ВЛИЯНИЕ  ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО  САХАРНОГО  ДИАБЕТА  НА  ПОКАЗАТЕЛИ  ИММУННОГО  ПРОФИЛЯ  ЛАБОРАТОРНЫХ  ЖИВОТНЫХ

Пак  Игорь  Евгеньевич

Кангельдиев  Алибек  Эркинбекович

студенты  4  курса  медицинского  факультета  КРСУ,  Кыргызстан,  г.  Бишкек

E -mail:  garik.park@mail.ru

Пак  Ирина  Владимировна

научный  руководитель,  канд.  мед.  наук,  доцент  кафедры  нормальной  и  патологической  физиологии  КРСУ,  Кыргызстан,  г.  Бишкек

Актуальность 

По  данным  Всемирной  организации  Здравоохранения  (ВОЗ)  сахарный  диабет  (СД)  одна  из  основных  причин,  приводящих  к  инвалидизации  и  смерти  населения  в  связи  с  повышенным  риском  сердечно-сосудистых  заболеваний.  Причем  наблюдается  устойчивая  тенденция  к  росту  заболеваемости:  если  в  2010  году  количество  больных  диабетом  было  284,6  млн.человек,  то  к  2030  году,  по  прогнозам  ВОЗ,  общее  количество  больных  при  сохранении  темпов  прироста  составит  уже  438,4  млн.  человек  и  диабет  станет  седьмой  по  значимости  причиной  смерти  в  мире  [13;  14].

Основной  причиной  смерти  при  СД  являются  вторичные  диабетические  осложнения,  такие  как  ангиопатия,  нефропатия,  ретинопатия  [1;  9].  Несмотря  на  то,  что  достигнуты  определенные  успехи  в  плане  лечения  СД,  современная  инсулиновая  терапия  не  может  остановить  развитие  и  прогрессирование  сосудистых  осложнений,  так  как,  по  сути,  является  заместительной,  а  не  патогенетической  терапией  [9].  Именно  это  заставляет  ученых  искать  принципиально  новые  подходы  к  лечению  сахарного  диабета.

В  настоящее  время  одной  из  наиболее  распространенных  экспериментальных  моделей  диабета  является  модель,  при  которой  СД  индуцируется  введением  моно-  или  тетрагидрата  аллоксана  [9;  11;  6].  Поражение  β-клеток  поджелудочной  железы  после  введения  аллоксана  приводит  к  метаболическим  последствиям,  характерным  для  абсолютной  инсулиновой  недостаточности,  что  по  патогенезу  напоминает  развитие  СД  1-го  типа.  Ряд  авторов  считают,  что  деструкция  β-клеток  под  действием  бетацитотропных  химических  веществ  может  быть  причиной  образования  аутоантител  вследствие  изменения  антигенной  структуры  мембраны  клетки  с  последующими  цитотоксическими  реакциями  [4;  10].  В  изучаемой  нами  литературе  данных  о  влиянии  аллоксаниндуцированного  сахарного  диабета  на  иммунный  статус  экспериментальных  животных  мы  не  нашли.  Это  и  предопределило  цель  нашего  исследования.

Цель  исследования   —  изучить  влияние  аллоксаниндуцированного  сахарного  диабета  на  показатели  клеточного  и  гуморального  иммунитета  экспериментальных  животных.

Материал  и  методы  исследования

Для  изучения  влияния  аллоксаниндуцированного  диабета  на  показатели  иммунного  профиля,  животные  были  условно  поделены  на  3  серии  опытов  (5,  15  и  30  сутки)  и  следующие  группы:

I   группа  —  интактные  животные,

II   группа  —  контрольная,  животные  с  аллоксаниндуцированным  СД. 

Для  работы  использовались  самцы  белых  лабораторных  крыс  половозрелого  возраста,  средней  массой  172,56+25,4  гр.  Экспериментальный  сахарный  диабет  вызывали  путем  подкожного  (в  область  передней  брюшной  стенки)  однократного  введения  тетрагидрата  аллоксана  (произ-во  «Sigma-Aldrich»),  в  дозе  170  мг/кг,  после  предварительного  24-часового  голодания  животных,  на  фоне  нормальных  показателей  уровня  глюкозы  в  крови  (у  всех  подопытных  животных  до  введения  аллоксана  он  не  превышал  6,0  ммоль/л)  [6;  11;  12].  Каждое  животное  взвешивали  на  электронных  весах  и  измеряли  уровень  глюкозы  крови  (глюкометр  «Optium»,  произ-во  «Abbott»).

Эффективность  экспериментальной  модели  сахарного  диабета  оценивали  по  общему  состоянию  животных,  мониторингу  диуреза  и  количества  выпитой  жидкости,  динамике  массы  тела  животных  и  уровню  глюкозы  крови. 

Иммунологические  исследования  включали  изучение  Т-  и  В-звеньев  иммунитета.  Содержание  в  крови  Т-  и  В-лимфоцитов  и  субпопуляций  Т-клеток  измеряли  методом  непрямой  поверхностной  иммунофлуоресценции  с  моноклональными  антителами  серии  ИКО,  использовали  «укороченную»  панель  для  идентификации  CD  маркеров:  CD3+  (Т-лимфоциты);  CD4+  (хелперные  Т-лимфоциты);  CD8+  (цитотоксические  лимфоциты);  CD20+  (В-лимфоциты);  CD16+(NK-клетки).  Концентрацию  иммуноглобулинов  сыворотки  крови  устанавливали  иммуноферментным  методом.  ЦИК  определяли  кадмиевым  тестом. 

Статистическую  обработку  результатов  проводили  с  использованием  пакета  прикладных  программ  «Microsoft  Excel»  с  расчетом  по  t-критерию  Стьюдента  и  вероятности  Р,  которую  признавали  статистически  значимой  при  Р<0,05.

Результаты  исследования

В  результате  проведенного  исследования  установлено,  что  подкожное  введение  тетрагидрата  аллоксана  в  дозе  170  мг/кг  приводит  к  развитию  диабета  у  подавляющего  большинства  животных.  Уже  на  вторые  сутки  после  индукции  аллоксанового  диабета  у  животных  наблюдались  явления  полифагии,  полидипсии  и  полиурии,  отмечалось  прогрессивное  снижение  массы  тела.  Так,  контрольное  взвешивание  экспериментальных  животных  на  30-е  сутки  наблюдения  показало,  что  вес  животных  снизился  в  среднем  на  15,0  %  от  исходных  значений,  а  суточная  потребность  в  выпиваемой  жидкости  увеличилась  в  2,5—3,5  раза  (Р<0,05).

Нарушение  инсулинпродуцирующей  функции  поджелудочной  железы  и  возникновение  диабетогенного  состояния  у  крыс,  которым  вводили  аллоксан,  подтвердилось  значительным  увеличением  концентрации  глюкозы  в  крови  животных  на  3,  5,  15  и  30-е  сутки  по  сравнению  с  исходным  уровнем  (рис.  1).

Рисунок  1.  Динамика  изменения  уровня  сахара  в  крови  у  экспериментальных  животных  на  фоне  индукции  аллоксана.  **  —  Р  <0.001,  достоверно  по  отношению  к  интактной  группе

Анализ  показателей  иммунной  системы  у  животных  с  аллоксаиндуцированным  сахарным  диабетом  показал,  что  общий  уровень  Т-лимфоцитов  имеет  тенденцию  к  увеличению  на  5-е  сутки,  15-е  сутки  и  30-е  сутки  наблюдения  по  сравнению  с  интактной  группой  животных  (Р>0,05),  причем  за  счет  роста  хелперной  активности  лимфоцитов,  что  связано  с  развитием  аутоиммунного  процесса  в  поврежденных  аллоксаном  β-  клетках  поджелудочной  железы.  Так,  на  5-е  сутки  эксперимента  уровень  Т-хелперов  (CD4⁺)  повысился  до  122,6  %  (Р<0,05),  тогда  как  уровень  цитотоксических  Т-лимфоцитов  (CD8⁺)  уменьшился  на  16,0  %  (Р<0,05).  Невысокий  уровень  цитотоксических  Т-лимфоцитов  объясняется,  возможно,  тем,  что  поврежденные  химическим  агентом  β-  клетки  поджелудочной  железы  обладают  слабыми  антигенными  свойствами.  На  15-е  и  30-е  сутки  изменения  со  стороны  CD4⁺  и  CD8⁺  достоверных  различий  с  группой  здоровых  животных  не  имели  (рис.2).

Усиление  хелперной  активности  субпопуляции  Т-лимфоцитов  при  индукции  сахарного  диабета  аллоксаном  было  подтверждено  увеличением  индекса  дифференцировки  (ID)  до  145,8  %  (Р<0,001),  123,3  %  (Р<0,05)  и  122,5  %  (Р<0,05)  на  5,  15  и  30-е  сутки  соответственно  по  сравнению  с  интактной  группой.  По  данным  литературы  изменение  ID  в  сторону  повышения  также  свидетельствует  о  развитии  аутоиммунного  процесса  в  организме  [4;  5;  10]. 

Рисунок  2.  Изменение  показателей  клеточного  и  гуморального  иммунитета  у  животных  с  аллоксаниндуцированным  сахарным  диабетом.  —  Р  <0,05,  достоверно  по  отношению  к  интактной  группе,  #  #  —  Р  <0,001,  достоверно  по  отношению  к  интактной  группе

Исследование  гуморального  звена  иммунитета  показало,  что  уровень  В-лимфоцитов  (CD20⁺)  в  крови  животных  с  аллоксаниндуцированным  диабетом  был  достоверно  выше  по  сравнению  с  интактной  группой  на  протяжении  всего  периода  наблюдения.  Так,  отмечен  подъем  уровня  CD20⁺  до  164,8  %  (Р<0,001)  на  5-е  сутки  эксперимента,  до  160,4  %  (Р<0,001)  на  15-е  сутки  и  до  139,0  %  (Р<0,05)  на  30-е  сутки  (рис.  2).  Увеличение  относительного  количества  В-лимфоцитов  объясняется  их  активацией  аутоантигенами  [4;  5;  10].  Активация  В-лимфоцита  предполагает  прямое  взаимодействие  антигена  с  IgM  на  поверхности  В-клетки.  При  связывании  антигена  с  соответствующим  рецептором  и  под  влиянием  цитокинов  (Ил-2,  Ил-4,  Ил-5  и  γ-ИФН),  вырабатываемых  Т-лимфоцитами,  происходит  активация  В-лимфоцитов,  которые  начинают  делиться  и  дифференцироваться  в  плазматические  клетки,  продуцирующие  антитела  (иммуноглобулины)  [4;  5;  7],  что  нашло  подтверждение  при  дальнейшем  исследовании  —  повышением  уровня  IgМ.

Изменения  уровня  ЦИК  (циркулирующих  иммунокомплексов)  и  показателя  NK-клеток  при  сравнении  с  интактной  группой  статистически  достоверных  различий  не  имели  (Р>0,05). 

В  дальнейшем  установлено,  что  концентрация  IgA  и  IgG  имела  лишь  тенденцию  к  увеличению  во  все  сроки  наблюдения  по  сравнению  с  группой  здоровых  животных.  Тогда  как  уровень  IgM  на  5-е  сутки  поднялся  до  145,4  %  (Р<0,05)  при  сравнении  с  интактной  группой  (рис.  3).

Рисунок  3.  Изменение  уровня  иммуноглобулинов  в  крови  у  животных  с  аллоксаниндуцированным  сахарным  диабетом.  #  -  Р  <0,05,  достоверно  по  отношению  к  интактной  группе

Выводы

В  результате  проведенных  исследований  выявлено,  что  экспериментальный  сахарный  диабет  помимо  гипергликемии  вызывает  изменения  иммунного  статуса,  выражающиеся  в  увеличении  относительного  количества  В-лимфоцитов,  Т-хелперов  и  секреции  иммуноглобулина  М,  что  обусловлено  цитотоксическим  действием  аллоксана  на  β-клетки  поджелудочной  железы,  приводящему  к  активации  клеточного  и  гуморального  иммунитета.

Список  литературы:

1.Балаболкин  М.И.  Сахарный  диабет  /  М.И.  Балаболкин.  М.:  Медицина,  1994.  —  384  с.

2.Балаболкин  М.И.  Новая  классификация,  критерии  диагностики  и  показатели  компенсации  сахарного  диабета  /  М.И.  Балаболкин,  Е.М.  Клебанова,  В.М.  Креминская  //  Терапевтический  архив.  —  2000.  —  №  10.  —  С.  5—10.

3.Балаболкин  М.И.  /  М.И.  Балаболкин,  В.А.  Сарана,  Л.А.  Стулий  //Вестн.  АМН  СССР.  —  1982.  —  №  2.  —  С.  33—39.

4.Злобина  Е.Н.  Современные  концепции  иммунопатогенеза  инсулинозависимого  сахарного  диабета  /  Е.Н.  Злобина,  И.И.  Дедов  //  Проблемы  эндокринологии.  —  1993,  —  №  9.  —  С.  51—58.

5.Клиническая  иммунология  и  аллергология  /  Под  ред.  Г.  Лоллора,  Т.  Фишера,  Д.  Адельмана.  М.:  Практика,  2000.  —  806  с.

6.Пак  И.В.  Аллоксаниндуцированный  диабет:  повышение  эффективности  экспериментальной  модели/  Тухватшин  Р.Р.,  Гизатулина  Р.Р.  //  Физиология,  морфология  и  патология  человека  и  животных  в  условиях  Кыргызстана:  Сб.науч.  тр.  Бишкек,  —  2008.  —  Вып.  8.  —  стр.  99—102.

7.Рабсон  А.  Основы  Медицинской  иммунологии  /  А.  Рабсон,  А.  Ройт,  П.  Делвз.  М.,  Мир,  2006.  —  320  с.

8.Розен  В.Б.  Основы  эндокринологии  /  В.Б.  Розен.  М.:  Высшая  школа,  1984.

9.Трансплантация  островковых  клеток  поджелудочной  железы  /  В.И.  Шумаков,  В.Н.  Блюмкин,  Н.Н.  Скалецкий  и  др.  М.:  Канон,  1995.  —  383  с.

10.Kukreja  A.  Autoimmunity  and  diabetes.  /  A.  Kukreja,  N.  Maclaren  //  Journal  of  Clinical  Endocrinology  and  Metabolism.  1999.  —  P.  4371—4378.

11.Misler  F.  Animal  models  of  diabetes  /  F.  Misler,  J.P.  Mordes,  A.A.  Rossini  //  Am.J.Med.  1981.  —  P.  353—360.

12.Pak  I.V.  Technology  of  standardization  xenogenic  cellular  pancreatic  transplantation  for  human  in  modeling  of  diabetes  mellitus  type  I,  induced  by  mezoxalilurea/  Zarifyan  A.G.,  Jylkichyeva  Ch.  S.  //  Проблемы  использования  современных  химических  технологий  в  биомедицине  и  здравоохранении:  Сб.науч.  тр.  МНТЦ  Бишкек,  2008.  —  стр.  17—21.

13.Материалы  сайта  [Электронный  ресурс]  —  Режим  доступа.  —  URL:  http://www.diabetesatlas.com/downloads

14.Материалы  сайта  [Электронный  ресурс]  —  Режим  доступа.  —  URL:  http://www.who.int/features/factfiles/diabetes/ru/