ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНОТОКСИЧНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ БАКТЕРИЙ

В настоящее время для выявления биологической активности факторов среды широко используются различные биосенсоры, основанные на использовании люминесцирующих бактерий. К таким биосенсорам можно отнести штаммы Escherichia coli, содержащие плазмиду, в которую встроена генетическая конструкция с индуцируемым промотором, слитым с lux-генами светящихся бактерий в качестве генов-репортеров. Такие штаммы предложены для детекции окислительного стресса [2], обнаружения генотоксикантов [10], антибиотиков и тяжелых металлов в окружающей среде [3;4].

Настоящая работа посвящена изучению возможности lux-биосенсора E. coli MG1655 (pRecA-lux) детектировать ДНК-повреждающую активность фармакологических средств по способности индуцировать SOS-ответ в клетках E.coli.

Материал и методы исследования

В работе применялся репортёрный штамм бактерий на основе E. coli K12 MG1655 (pRecA-lux), несущего плазмиду с генными сшивками recA::luxCDABE. Данный штамм Е. coli, несущий Iux-оперон, под воздействием ДНК-повреждающих веществ начинает активно продуцировать люциферин-люциферазный комплекс, что приводит к повышению уровня биолюминесценции.

Штаммы lux-биосенсоров предоставлены проф. Чистяковым В.А., зав. лаборатории экспериментального мутагенеза НИИ Биологии ЮФУ. Их генотипы и описание конструкций, несущих ими рекомбинантных плазмид приведены в работах [2; 3].

Бактерии выращивали в бульоне Луриа-Бертрана (LB), содержащем 100 мкг/мл ампициллина. Ночную культуру разводили до концентрации 10⁷ кл/мл в свежем бульоне и растили при 37°С 2 ч. Затем пробы по 90 мкл вносили в лунки 96-луночного планшета с 10 мкл раствора тестируемого вещества в различной концентрации. Для индукции SOS-ответа в качестве положительного контроля был использован антибактериальный диоксидин,  активность которого на биосенсоре Е. coli MG1655 (pRecA-lux) хорошо изучена [7].

В качестве отрицательного контроля использовали дистиллированную воду. Интенсивность биолюминесценции измеряли на микропланшетном люминометре Luminometer photometer LM 01A. Инкубацию после добавления тестируемого вещества проводили при 37°С в течение 120 минут. Фактор индукции вычисляли по формуле: R = I_ind /I₀, где I₀  - уровень спонтанной люминесценции культуры ( без индуктора), I_ind  -  уровень люминесценции в присутствии исследуемого препарата.

Результаты и обсуждение

Оценку генотоксичности лекарственных средств фурацилина и метронидазола определяли по  повышению уровня индукции люминесценции биосенсора Е. coli MG1655 (pRecA-lux). В качестве положительного контроля выбран диоксидин, для которого была определена оптимальная концентрация равная 2,25*10^-5  (табл.1). При данной концетрации  диоксидин вызывает максимальный уровень люминесценции.

Полученные результаты активности фурацилина и  метронидазола при различных концентрациях представлены в таблицах 1, 2 и рис. 1,2.  Как известно, индукция люминесценции биосенсора  будет зависеть  концентрации, природы и фактора, вызывающего SOS-ответ. Были определены оптимальные концентрации лекарственных препаратов вызывающие индукцию люминесценции и основные  параметры, характеризующие отклик штамма на воздействие лекарственных препаратов: фурацилина и метронидазола. 

Таблица 1.

Результаты тестирования фурацилина с использованием биосенсора E. coli MG1655 (pRecA-lux)

Рисунок 1. Зависимость индукции люминесценции штамма Е. coli MG1655 (рRecA-lux) от концентрации фурацилина

Таблица 2.

Результаты тестирования метронидазола с использованием биосенсора E. coli MG1655 (pRecA-lux)

Рисунок 2. Зависимость индукции люминесценции штамма Е. coli MG1655 (рRecA-lux)  от концентрации метронидазола

Как видно по табл.3, минимальная концентрация лекарственных препаратов, при воздействии которых начинается повышение уровня свечения у фурацилина (R=2) равна 10^-6 M, у метронидазола (R=2) равна 3*10^-4 M. Максимальных значений достигли при 10^-4 M фурацилина (R=3), при 1,5*10^-2 M метронидазола (R=5).

Как фурацилин, так метранидазол оказывают более слабый генотоксический эффект, чем диоксидин, использованный в качестве позитивного контроля.  Из таблицы 3 видно, что  оба вещества индуцировали наибольший уровень люминесценции биосенсора Е. coli MG1655 (рRecA-lux) при более высоких концентрациях (10^-4М и 10^-2М, соответственно), чем диоксидин (2,25*10^-5М).

 Таблица 3.

Результаты тестирования  лекарственных препаратов с использованием биосенсора E. coli MG1655 (pRecA-lux)

R* – фактор индукции. R рассчитан для минимальной и  максимальной концентраций тестируемых веществ по формуле R = Iind /I0,  где I0  - уровень спонтанной люминесценции культуры (в отсутствие индуктора), Iind  -  уровень люминесценции в присутствии исследуемого препарата.

Изучаемые лекарственные препараты (фурацилин и метронидазол) как химические соединения являются нитросоединениями и содержат  в своей структуре нитрогруппы. При воздействии бактериальной нитроредуктазой на вещества данной группы в результате восстановления образует реакционноспособный нитроксильный радикал [8]. Нитрогруппы расположены строго в положении 5 фуранового цикла, и различия в активности и спектре действия 5-нитрофурановых соединений зависят от характера заместителей в положении 2 фуранового цикла. Испытанные лекарственные средства при исследовании на тесте Эймса (на тест-штаммах S. typhimurim) показывают мутагенную активность[1, 9]. В данном исследовании  также индуцировали SOS-ответ у Е. coli MG1655 (pRecA-lux).

Диоксидин, использованный в качестве позитивного контроля, является мутагеном в тесте Эймса и индуцирует хромосомные аберрации в клетках млекопитающих как in vitro, так и in vivo [5; 6]. Полагают, что он является ингибитором синтеза ДНК, однако механизм такого действия до сих пор не установлен. Известно, что SOS-ответ в клетках Е. coli индуцируется в ответ на остановку синтеза ДНК в результате повреждений ДНК (разрывы, сшивки нитей и др.). Полученные результаты указывают на то, что метронидазол и фурацилин обладают ДНК-повреждающим эффектом на биосенсор E. coli MG1655 (pRecA-lux), что подтверждает генотоксичность этих препаратов.

Список литературы:

1. Игонина Е.В. Lux-биосенсоры: скрининг биологически активных соединений на генотоксичность. / Е.В.Игонина, М.В.Марсова, С.К.Абилев //Экологическая генетика. 2016. Т.9. №4. С.52-62.
2. Котова В.Ю. Lux-биосенсоры для детекции SOS-ответа, теплового шока и окислительного стресса. /В.Ю.Котова, И.В.Манухов, Г.Б.Завильгельский //Биотехнология. 2009. №6. С.16-25
3. Котова В.Ю. Индуцируемые специфические Luxбиосенсоры для детекции антибиотиков: конструирование и основные характеристики./ В.Ю.Котова, К.В.Рыженкова, И.В.Манухов, Г.Б.Завильгельский //Прикладная биохимия и микробиология. 2014. №1. С. 112-117
4. Сазыкина M.A. Использование бактериального lux-биосенсора для детекции загрязнения природных вод ртутью.  /M.A.Сазыкина, B.A.Чистяков, К.С.Сазыкин, Л.П.Лагутова, Е.М.Новикова, А.В.Латышев //Вода: химия и экология. 2010. №5. Р. 24-29
5. Фонштейн Л.М. Изучение мутагенного действия некоторых лекарственных препаратов на индикаторные бактерии. /Л.М.Фонштейн, С.К.Абилев, Л.П.Акиньшина и др. //Химико-фармацевтический журнал. 1978. № 1. С. 39–44.
6. Фонштейн Л.М. Изучение мутагенной активности диоксидина. / Л.М.Фонштейн, Ю.А.Ревазова, Г.Н.Золотарева и др.  // Генетика. 1978. Т. 14. № 5. С. 900–908.
7. Mazanko M.S. Dioxidine Induces Bacterial Resistance to Antibiotics./M.S. Mazanko, V.A. Chistyakov, E.V. Prazdnova, I.O. Pokudina, M.N. Churilov, V.K. Chmyhalo, M.M. Batyushin. // Molekulyarnaya Genetika. 2016. №4. Р. 149–154.
8. McCalla DR. Mutagenicity of nitrofuran derivatives: Review. / DR.McCalla //Environ Mutagen. 1983. №5. Р. 745-765.
9. McCann J. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/ microsome test: assay of 300 chemicals. / J McCann, E Choi, E Yamasaki, BN.Ames //Proc Natl Acad Sci USA. 1975. №72 (12). Р. 5135-5139.
10. Ptitsyn L.R. A biosensor for environmental genotoxin screening based on an SOS lux assay in recombinant Escherichia coli cells. / L.R.Ptitsyn, G.Horneck, О.Komova, S.Kozubec, E.A.Krasavin, M. Bonev, P. A Rettberg //Appl. Environ. Microbiol. 1997. №11. V.63. Р. 4377-4384