ИЗУЧЕНИЕ  ГУМОРАЛЬНОГО  ЗВЕНА  СПЕЦИФИЧЕСКОГО  ИМУНИТЕТА  ПРИ  ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ  МОДЕЛИ  РАССЕЯННОГО  СКЛЕРОЗА  —  АЛЛЕРГИЧЕСКОГО  ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА

Милихина  Наталья  Владимировна

магистрант  2  курса,  кафедра  биохимии  СамГУ,  РФ,  г.  Самара

E-mail: 

Макурина  Ольга  Николаевна

научный  руководитель,  д-р  биол.  наук,  профессор  СамГУ,  РФ,  г.  Самара

Рассеянный  склероз  (РС)  —  хроническое  заболевание  центральной  нервной  системы  (ЦНС),  которым  в  мире  страдают  более  1  млн.  человек,  относят  к  категории  аутоиммунных.  Этиология  РС  остается  неясной.  Более  всего  вероятна  его  многофакторная  (комплексная)  природа  —  воздействие  внешних  факторов  на  индивиды  с  наследственной  предрасположенностью.  Основную  роль  в  патогенезе  РС  играет  сочетание  хронического  воспалительного  и  нейродегенеративного  процессов,  в  генезе  которых  существенную  роль  играют  аутоиммунные  процессы  [2].

Хотя  ведущим  аутоиммунным  механизмом  при  РС  является  Т-клеточный  иммунитет,  в  развитии  заболевания  участвует  и  В-система  (гуморальный  иммунитет)  [6].  Одним  из  проявлений  активации  гуморального  иммунитета  при  РС  является  повышенный  синтез  в  ткани  мозга  и  спиномозговой  жидкости  иммуноглобулинов,  обычно  Ig  G  [3].

Важную  роль  в  понимании  иммунопатогенеза  демиелинизирующих  заболеваний  нервной  системы,  в  том  числе  РС,  внесла  разработка  экспериментальных  моделей,  в  частности  экспериментального  аллергического  энцефаломиелита.  Экспериментальный  аллергический  энцефаломиелит  (ЭАЭ)  признается  в  настоящее  время  достаточно  адекватной  моделью  РС,  поствакцинальных  энцефаломиелитов,  острого  диссеминированного  энцефаломиелита  и  некоторых  других  аутоиммунных  демиелинизирующих  заболеваний  человека,  так  как  клинические,  морфологические,  иммунологические  и  биохимические  проявления  указанных  заболеваний  имеют  принципиальное  сходство  с  экспериментальной  моделью.  Использование  данной  модели  позволяет  значительно  расширить  и  усугубить  исследование  вопросов  патогенеза,  клиники  и  рациональной  терапии  таких  заболеваний  [4].

Исследования  проводили  на  взрослых  кроликах-самцах  породы  шиншилла  массой  2,5—3,0  кг,  у  которых  вызывали  ЭАЭ  путем  однократной  внутрикожной  инокуляции  в  подушечки  лап  1  мл  (по  0,25  мл  в  каждую  лапу)  энцефалитогенной  эмульсии,  содержащей  20  мг  лиофилизированного  миелина  спинного  мозга  кроликов,  0,2  мл  физиологического  раствора  и  0,8  мл  полного  стимулятора  Фрейнда  (100  мг  сухих,  убитых  нагреванием  M.tuberculosis,  15  г  ланолина  и  15  г  вазелинового  масла).

Первые  симптомы  появились  после  10—12  дневного  латентного  периода:  ухудшалось  общее  состояние  и  аппетит,  начиналась  снижаться  масса  тела,  а  к  концу  второй  недели  появились  первые  неврологические  симптомы,  которые  в  дальнейшем  прогрессировали,  достигая  максимума  на  23—27  день.  При  этом  наблюдались  двигательные  нарушения  (атаксия,  мышечная  слабость,  парезы  и  параличи  конечностей),  а  также  расстройство  функций  тазовых  органов  (непроизвольная  дефекация  и  мочеиспускание).

В  нашей  работе  мы  определяли  содержание  иммуноглобулинов  трех  основных  классов  —  IgM,  IgG,  IgA,  уровень  циркулирующих  иммунных  комплексов  (ЦИК)  и  титр  комплемента.

Определение  активности  системы  комплемента  основано  на  феномене  лизиса  эритроцитов  в  присутствии  антиэритроцитарных  антител  и  комплемента.  Для  определения  активности  комплемента  в  исследуемую  сыворотку  вводят  гемолитическую  тест-систему,  состоящую  из  эритроцитов  барана  и  гемолитической  сыворотки  (сыворотка,  полученная  от  животного,  иммунизированного  бараньими  эритроцитами,  и  содержащая  антиэритроцитарные  антитела).  Комплемент  исследуемой  сыворотки,  связываясь  с  комплексом  антиген-антитело  (в  данном  случае  эритроциты  —  гемолизины),  вызывает  гемолиз.

Активность  комплемента  выражают  в  гемолитических  единицах.  За  одну  50  %  гемолитическую  единицу  комплемента  (CH₅₀)  принимают  такое  его  количество,  которое  вызывает  гемолиз  50  %  0,5  мл  стандартной  суспензии  сенсибилизированных  эритроцитов  при  37  °С  за  45  мин.  Эта  единица  условная,  величина  ее  зависит  от  концентрации  бараньих  эритроцитов,  количества  антител,  использованных  для  сенсибилизации,  величины  рН,  ионной  силы  системы.  В  связи  с  тем,  что  присоединение  к  иммунному  комплексу  первого  компонента  комплемента  не  происходит  в  отсутствие  Ca²⁺,  а  для  присоединения  4-го  компонента  (следующего  за  активацией  C1)  необходимо  наличие  Mg²⁺,  важно  строго  соблюдать  концентрацию  этих  веществ  в  буферных  растворах.  Необходимо  стандартизировать  время  реакции,  температуру  [5].

Определение  иммуноглобулинов  в  сыворотке  крови  проводили  твердофазным  методом,  который  проводится  на  принципе  «сэндвича».  На  первой  стадии  калибровочные  пробы  с  известной  концентрацией  IgA,  M,  G  и  исследуемые  образцы  инкубируются  в  лунках  стрипированного  планшета  и  иммобилизированными  моноклональными  антителами  (МКАТ)  к  Ig.  Затем  планшет  отмывается.  На  второй  стадии  связавшийся  в  лунках  Ig  обрабатывают  конъюгатом  МКАТ  к  Ig  с  пероксидазой  (конъюгат  МКАТ  и  иммобилизированные  в  лунках  планшета  МКАТ  специфичны  к  разным  участкам  молекулы  Ig).  После  отмывания  избытка  конъюгата  образовавшиеся  иммунные  комплексы  «иммобилизированные  МКАТ  —  Ig  —  конъюгат»  выявляют  ферментативной  реакцией  пероксидазы  с  перекисью  водорода  в  присутствии  хромогена  (тетраметилбензидина).  Интенсивность  окраски  хромогена  пропорциональна  концентрации  Ig  в  анализируемом  образце.  После  постановки  пероксидазной  реакции  стоп-реагентом  результаты  учитываются  фотометрически.  Концентрацию  Ig  в  пробах  определяют  по  калибровочному  графику  [4].

Определение  уровня  циркулирующих  иммунных  комплексов  в  сыворотке  основано  на  принципе  связывания  антигена  с  антителом  с  образованием  иммунного  комплекса.  Циркулирующие  иммунные  комплексы  (ЦИК)  способны  присоединять  компоненты  комплемента  и  образовывать  комплекс  антиген-антитело-комплемент,  который  оседает  в  тканях,  сосудистой  стенке,  вызывая  повреждения  различной  степени  тяжести  вследствие  активации  системы  комплемента.  Большая  группа  заболеваний  патогенетически  тесно  связана  с  образованием  и  персистенцией  ЦИК.  В  связи  с  этим  уровень  ЦИК  в  сыворотке  крови  является  одним  из  диагностических  показателей  активости  и  степени  тяжести  иммунопатологического  процесса.

Принцип  метода  определения  ЦИК  основан  на  изменении  величины  светового  рассеяния  раствора  полиэтиленгликоля  в  следствии  осаждения  им  ЦИК  из  сыворотки  крови.

Прогресс  в  изучении  механизмов  формирования  патологического  процесса  демиелинизирующих  заболеваниях  достигнут,  главным  образом,  в  ходе  иммунологических  исследований.  Основой  для  этого  послужили  достижения  теоретической  иммунологии.  При  столкновении  организма  с  патогеном  в  иммунной  системе  запускается  процесс  клональной  селекции,  когда  стимулируются  клоны,  несущие  соответствующие  рецепторы.  Этот  механизм  объясняет  громадный  приспособительный  потенциал  иммунной  системы.  В  ходе  иммунных  реакций  Т-  и  В-клетки  взаимодействуют.  В-клетки  могут  захватывать  антигены  своими  рецепторами  и  презентировать  его  на  своей  поверхно­сти.  В  этом  виде  антиген  узнается  антигенспецифическими  рецепторами  соответствующих  клеток  Т-хелперов,  которые  побуждают  В-клетки  к  росту  и  дальнейшим  генетическим  модификациям.  Результатом  этих  процессов  является  синтез  специфических  антител.  Антитела  связывают  и  нейтрализуют  патоген  в  экстрацеллюлярном  пространстве,  делают  его  возможным  для  по­глощения  фагоцитами  и  активируют  комплементарный  каскад.  Повреждение  олигодендроцитов  и  миелина,  вызванное  антителами,  реализуется  посредством  нескольких  механизмов,  характерных  для  гуморального  ответа,  направленного  на  элиминацию  любых  чужеродных  клеток  и  макромолекул.  Первый  механизм  заключается  в  простом  связывании  антител  с  антигенами.  Другой  механизм  —  реализуется  при  связывании  Fc-фрагмента  иммуноглобулинов  с  Fc-рецептором  на  макрофагах  и  микроглии  с  образованием  комплекса  IgG­Fc-рецептор,  что  значительно  увеличивает  скорость  рецептор-  опосредованного  фагоцитоза  миелина.  Третий  механизм  связан  с  активацией  системы  комплемента  иммуноглобулинами  класса  М  и  большинством  подклассов  иммуноглобулинов  класса  G.

Контрольные  значения  соответствующих  показателей  были  получены  при  исследовании  здоровых  кроликов.  Собственно  контрольную  группу  составили  3  кролика  без  неврологических  симптомов.  Титр  комплемента  составил  29,3±0,51;  циркулирующие  иммунные  комплексы:  мелкомолекулярные  0,068±0,004  у.е.,  среднемолекулярные  0,074±0,004  у.е.  и  крупномолекулярные  0,065±0,002  у.е.  Иммуноглобулины  классов  А,  М,  G  —  2,93±0,154  мг/мл,  2,16±0,07  мг/мл,  9,04±0,146  мг/мл  соответственно.

При  изучении  титра  комплемента  мы  установили,  что  при  легкой  степени  тяжести  происходит  увеличение  титра  на  5%,  при  средней  степени  тяжести  на  7,2  %  (см  рисунок  1).

Рисунок  1.  Реакция  связывания  комплемента

Данные  о  содержании  иммуноглобулинов  классов  А,  М,  G  в  крови  весьма  малочисленны.  Сообщается  о  снижении  уровня  Ig  G  и  повышении  уровня  Ig  М  в  сыворотки  крови  [4].  В  сыворотке  крови  кроликов,  зараженных  ЭАЭ,  происходила  активация  выработки  иммуноглобулинов  класса  М  у  легкой  степени  тяжести  на  43,5  %  и  у  средней  степени  тяжести  на  50  %  по  сравнению  с  контролем;  и  увеличение  выработки  иммуноглобулинов  класса  G  на  36,4  %  и  на  53,7  %  соответственно  (см.  рисунок  2).

Рисунок  2.  Изменение  иммуноглобулинов  сыворотки  крови  при  ЭАЭ

Проводя  анализ  содержания  сывороточных  иммуноглобулинов  классов  А,  М,  G  при  экспериментальной  модели  рассеянного  склероза  выявлено  повышение  содержания  Ig  M  и  незначительное  снижение  уровня  Ig  G.  Изменение  же  уровня  Ig  A  в  сыворотке  при  аллергическом  энцефаломиелите  не  является  показателем  для  данного  заболевания.

При  экспериментальной  модели  рассеянного  склероза  происходит  увеличение  содержания  циркулирующих  иммунных  комплексов  в  сыворотке  крови.  У  легкой  формы  возрастает  содержание  среднемолекулярных  ЦИК  на  9  %  по  сравнению  с  контрольной  группой,  а  при  средней  форме  заболевания  на  21  %.  Так  же  происходит  возрастание  крупномолекулярной  формы  ЦИК  у  легкой  формы  заболевания  на  12  %,  а  у  средней  на  38  %  (см  рисунок  3).

Рисунок  3.  Изменение  показателей  циркулирующих  иммунных  комплексов  при  ЭАЭ

Таким  образом,  результаты  исследования  при  экспериментальной  модели  рассеянного  склероза  —  аутоиммунном  аллергическом  энцефаломиелите  позволили  установить,  что  при  данном  заболевании  происходит  активация  гуморального  звена  иммунитета,  которая  проявляется  в  нарастании  титра  комплемента,  увеличении  выработки  иммуноглобулинов  класса  М  и  G,  и  увеличении  количества  циркулирующих  иммунных  комплексов  в  сыворотке  крови  опытных  животных.

Список  литературы:

1.Бойко  А.Н.  Рассеянный  склероз:  молекулярные  и  клеточные  механизмы  /  А.Н.  Бойко  //  Молекулярная  биология.  —  1995.  —  Вып.  4.  —  С.  727—749.

2.Гусев  Е.И.  Рассеянный  склероз:  от  изучения  иммунопатогенеза  к  новым  методам  лечения  /  Е.И.  Гусев,  А.Н.  Бойко  М.:  Губернская  медицина,  2001.  —  256  с.

3.Гусев  Е.И.  Рассеянный  склероз  /  Е.И.  Гусев,  Т.Л.  Демина,  А.Н.  Бойко  М.:  Нефть  и  газ,  1997.  —  124  с.

4.Лебедев  К.А.  Иммунограмма  в  клинической  практике  /  К.А.  Лебедев,  И.Д.  Понякина  М.:  Наука,  1990.  —  224  с.

5.Новиков  П.Д.  Принципы  оценки  иммунного  статуса  и  диагностики  иммунодефицитных  болезней  /  П.Д.  Новиков,  Н.Ю.  Коневалова,  Н.Д.  Титова  //  Иммунопатология.  —  2005.  —  №  2.  —  С.  8—22.

6.Archelos  J.J.  The  role  of  B  cells  and  autoantibodies  promotes  central  nervous  systems  remyelination  /  J.J.  Archelos,  M.K.  Storch,  H.P.  Hartung  //  Multiple  sclerosis  —  1998.  —  №  4.  —  Р.  217—221.