ОЦЕНКА  ЭНДОГЕННОЙ  ИНТОКСИКАЦИИ  ОРГАНИЗМА  ПРИ  ХРОНИЧЕСКОМ  НЕОБСТРУКТИВНОМ  БРОНХИТЕ  ПО  УРОВНЮ  СРЕДНИХ  МОЛЕКУЛ  И  ЦИРКУЛИРУЮЩИХ  ИММУННЫХ  КОМПЛЕКСОВ

Завальная  Евгения  Генриховна

студент  3  курса,  кафедра  клеточной  биологии  и  генетики  ДВФУ,  РФ,  г.  Владивосток

E-mail:  eugenia_94@inbox.ru

Виткина  Татьяна  Исааковна

научный  руководитель,  д-р  биол.  наук,  ведущий  научный  сотрудник  лаб.  биомедицинских  исследований  Владивостокского  филиала  ФГБУ  ДНЦ  ФПД  СО  РАМН-НИИ  МКВЛ,  РФ,  г.  Владивосток

Токмакова  Наталья  Павловна

научный  руководитель,  канд.  биол.  наук,  доцент,  кафедра  клеточной  биологии  и  генетики,  ДВФУ,  РФ,  г.  Владивосток

На  современном  этапе  хронический  бронхит  (ХБ)  занимает  значительную  часть  в  структуре  общей  заболеваемости.  Болезнь  поражает  наиболее  трудоспособную  часть  населения,  формируясь  в  возрасте  20—39  лет,  имеет  рецидивирующее  течение  и  через  15—20  лет  может  занять  лидирующее  положение  среди  хронической  патологии  [6,  с.  5].  Значимую  роль  в  этиопатогенезе  ХБ  играет  синдром  эндогенной  интоксикации  (ЭИ),  являющийся  одним  из  главных  факторов,  определяющих  тяжесть  течения  хронических  патологий  [1,  с.  60;  7,  с.  20].  Повреждающими  агентами  становятся  биологически  активные  вещества,  которые  приобретают  свойства  эндогенных  токсических  субстанций.  Циркулирующие  в  крови  эндотоксины  способны  блокировать  рецепторный  аппарат  клетки  и  приводить  к  фармакорезистентности  [8,  p.  455;  9,  p.  1336]. 

Универсальным  биохимическим  маркером  ЭИ  является  уровень  «средних  молекул»  (СМ)  [2,  с.  3].  Накопление  СМ  вследствие  усиленного  образования  или  снижения  выведения  ведет  к  развитию  патологических  состояний,  обусловленных  их  выраженной  биологической  активностью.  В  частности,  такой  эффект  присущ  молекулам  в  составе  циркулирующих  иммунных  комплексов  (ЦИК)  [2,  с.  3].  Проблема  формирования  и  характер  последующего  клинического  течения  ХБ  в  патогенетическом  плане  в  значительной  степени  связаны  с  накоплением  в  жидких  средах  организма  ЦИК  на  фоне  недостаточности  фагоцитарных  механизмов  их  элиминации  [5,  с.  12]. 

Целью  исследования  явилась  оценка  уровня  и  характера  течения  эндогенной  интоксикации  по  уровню  средних  молекул  и  содержанию  ЦИК  у  больных  хроническим  необструктивным  бронхитом  (ХНБ).

Материалы  и  методы

Работа  выполнена  на  базе  Владивостокского  филиала  ФГБУ  «ДНЦ  ФПД»  СО  РАМН-НИИ  МКВЛ.  Обследовали  15  женщин  и  15  мужчин  больных  хроническим  необстуктивным  бронхитом  в  фазе  ремиссии,  средний  возраст  которых  составил  48,  4  лет  (от  35  до  65  лет).  Диагноз  ХБ  выставлен  на  основании  клинико-анамнестических  данных,  результатов  спирографии,  лабораторных  исследований.  Контрольная  группа  включала  27  практически  здоровых  лиц,  сопоставимых  по  полу  и  возрасту.  Все  исследования  выполнены  с  информативного  согласия  пациентов  и  в  соответствии  с  этическими  нормами  Хельсинской  Декларации  (2006). 

Определение  веществ  низкой  и  средней  молекулярной  массы  (ВН  и  СММ)  проводили  в  периферической  крови  по  методу  Малаховой  (2000)  [3,  с.  3],  принцип  которого  состоит  в  регистрации  неосаждаемых  трихлоруксусной  кислотой  (ТХУ)  компонентов  плазмы  в  диапазоне  длин  волны  222—294  нм  путем  прямой  ультрафиолетовой  спектрофотометрии  (спектрофотометр  Biotek  PW,  США).  Уровень  средних  молекул  значительно  варьирует  в  зависимости  от  пола,  в  связи  с  чем  показатели  определяли  отдельно  для  женщин  и  мужчин.

Рассчитывали  пептидно-нуклеотидный  коэффициент  (OD238/OD260),  указывающий  на  соотношение  сдвигов  в  содержании  пептидов  и  нуклеотидов  в  пуле  ВСНММ;  коэффициент  ароматичности  (OD238/OD280),  свидетельствующий  о  вкладе  пептидов,  не  содержащих  ароматичных  хроматофоров;  о  соотношении  хроматофоров  ароматической  и  неароматической  природы. 

Для  дифференцированного  определения  в  сыворотке  крови  уровня  циркулирующих  иммунных  комплексов  крупных  и  мелких  размеров  кровь  исследовали  по  методу  Немова,  Попковой  (2011)  [4].  Принцип  метода  заключался  в  преципитации  циркулирующих  иммунных  комплексов  растворами  полиэтиленгликоля  (ПЭГ-6000)  с  конечной  концентрацией  4  %  и  6  %.  Данные  регистрировали  с  помощью  микропланшетного  спектрофотометра,  измеряя  оптическую  плотность  (ОП).  На  основании  полученных  данных  ОП  рассчитывали  уровень  крупных  и  мелких  циркулирующих  иммунных  комплексов  (кЦИК  и  мЦИК  соответственно)  и  коэффициент  соотношения,  в  усл.  ед.:

кЦИК  =  (ОП  ср  .  р-р  2  –  ОП  ср  .  р-р  1)  ×  1000;

мЦИК  =  (ОП  ср  .  р-р  3  –  ОП  ср  .  р-р  1)  ×  1000;

К  =  мЦИК/кЦИК,

где:  ОП  ср.  —  среднеарифметическое  значение  оптической  плотности  образца, 

р-р  1  —  забуференный  физиологический  раствор  (pH  7,4); 

р-р  2  —  8  %  раствор  ПЭГ; 

р-р  3  —  12  %  раствор  ПЭГ.

Статистическую  обработку  данных  осуществляли  при  помощи  программы  Statistica  6.0.  Производили  нормирование  показателей  относительно  параметров  группы  здоровых  людей.  Данные  представляли  в  виде  медианы  и  квартилей.  Сравнение  количественных  переменных  независимых  выборок  производилось  с  помощью  критерия  Манна-Уитни.

Результаты  и  обсуждение

Анализ  данных  показал,  что  общее  содержание  средних  молекул  в  плазме  у  обследуемых  возрастает  на  13  %  (р<0,05)  у  женщин  и  на  27  %  (р<0,01)  у  мужчин,  что  свидетельствует  о  развитии  при  ХНБ  эндогенной  интоксикации,  соответствующей  среднему  уровню  (табл.  1;  табл.  2).

Таблица  1.

Общее  содержание  средних  молекул  и  их  отдельных  фракций  в  исследуемых  группах  (мужчины)

Таблица  2.

Общее  содержание  средних  молекул  и  их  отдельных  фракций  в  исследуемых  группах  (женщины)

ЭИ  может  быть  вызвана  не  только  увеличением  содержания  каких-то  конкретных  веществ,  но  и  нарушением  равновесия  между  отдельными  компонентами  пула  СМ.  В  связи  с  этим  были  рассчитаны  коэффициенты  распределения,  позволяющие  получить  интегральную  информацию  о  состоянии  систем  организма.  Это  позволило  выявить  перераспределение  содержания  пептидов  и  нуклеотидов  в  пуле  СМ,  что  отражается  в  возрастании  пептидно-нуклеотидного  коэффициента.  Его  прирост  у  мужчин  с  ХНБ  достигает  32  %  (р<0,01),  у  женщин  с  ХНБ  —  20  %  (р<0,05).  Значимых  изменений  нуклеарной  фракции,  представленной  эндогенными  патогенами  в  виде  продуктов  разрушения  ДНК,  вышедших  из  цитозоля  при  нарушении  целостности  клеточных  мембран,  у  пациентов  с  ХНБ  не  выявлено. 

Наиболее  значительно  изменяется  при  ХНБ  коэффициент  ароматичности,  у  мужчин  он  увеличивается  на  70  %  (р<0,01),  у  женщин  на  30  %  (р<0,01).  Это  свидетельствует  о  сдвиге  соотношения  хроматофоров  ароматической  (гистидин,  фенолы,  тирозин,  триптофан,  фенилаланин)  и  неароматической  природы  (цистеин,  глицин,  глутаминовая  кислота,  метионин)  и  о  преимущественном  вкладе  пептидов,  не  содержащих  ароматичных  хроматофоров  в  процесс  ЭИ  при  ХНБ. 

Содержание  токсической  фракции  возрастало  в  большей  степени  у  мужчин  (на  18  %)  (р<0,05),  у  женщин  увеличение  составило  9  %  (р<0,05).  Токсическая  фракция,  регистрируемая  на  длине  волны  254  нм,  состоит  из  гидрофобных  токсинов,  обладающих  высоким  сродством  к  биологическим  структурам,  находящимся  в  плазме  в  практически  полностью  связанном  состоянии  в  виде  комплексов  с  альбумином  или  липопротеинами  низкой  плотности.

Проведенное  исследование  демонстрирует  развитие  эндогенной  интоксикации  у  пациентов  с  ХНБ,  характеризующееся  увеличением  уровня  СМ,  перераспределением  содержания  пептидов  и  нуклеотидов,  возрастанием  содержания  токсической  фракции  СМ,  преобладанием  продуктов  распада  белков,  содержащих  ароматические  аминокислоты.

Результаты  исследования  циркулирующих  иммунных  комплексов  контрольной  группы  и  больных  ХНБ  представлены  в  табл.  3.

Таблица  3. 

Уровень  ЦИК  у  больных  ХНБ  и  обследуемых  контрольной  группы

В  группе  больных  ХНБ  отмечалось  повышение  ЦИК  в  среднем  в  1,3  раза  по  отношению  к  группе  здоровых  людей.  Их  накопление  в  крови  пациентов  ХНБ  является  признаком  протекающего  воспалительного  процесса.  Экзо-  и  эндотоксины,  в  том  числе  молекулы  средней  массы,  стимулируют  аутоиммунные  реакции  с  увеличением  содержания  крупно-  и  низкомолекулярных  токсических  циркулирующих  иммунных  комплексов.  Образующиеся  комплексы  способны  откладываться  в  тканях  и  вызывать  воспалительные  реакции,  замыкая,  таким  образом,  цикл  по  типу  «порочного  круга».

Содержание  высокомолекулярных  ЦИК  возросло  с  41  до  70,5  условных  единиц  (на  72  %,  р<0,05).  Уровень  содержания  малых  форм  циркулирующих  иммунных  комплексов  в  группе  людей  с  заболеванием  составляет  265,5  условных  единиц  оптической  плотности,  что  превышает  их  содержание  в  группе  здоровых  людей  на  18  %  (р<0,05).  Молекулярная  масса  ЦИК  предопределяет  степень  их  патогенности,  где  наиболее  значимым  показателем  иммунологической  реактивности  являются  молекулы  мелких  размеров.  Возрастание  уровня  ЦИК,  обеспеченное  преимущественно  за  счет  накопления  крупных,  менее  патогенных  молекул,  говорит  о  стационарной  стадии  протекания  болезни.  Укрупнение  молекул  ЦИК  —  процесс,  обеспечивающий  их  нормальную  элиминацию  и  отражающий  компенсаторную  реакцию  организма  на  возрастание  их  количества.

Ввиду  изменений  в  соотношении  между  высокомолекулярными  и  низкомолекулярными  циркулирующими  иммунными  комплексами  показатели  коэффициента  снизились  на  21  %  (р<0,05). 

Сравнительный  анализ  концентрации  циркулирующих  иммунных  комплексов  в  исследуемых  группах  позволил  выявить  увеличение  уровня  ЦИК  при  ХНБ,  при  этом  увеличение  затрагивало  как  крупные,  так  и  мелкие  формы.  При  изучении  соотношения  их  крупно-  и  малоразмерных  молекул  наблюдалось  перераспределение  в  пользу  крупномолекулярных  комплексов  в  группе  с  ХНБ,  повлекшее  за  собой  снижение  коэффициента.

Таким  образом,  проведенное  исследование  позволило  детектировать  увеличение  концентрации  средних  молекул  и  циркулирующих  иммунных  комплексов,  что  свидетельствует  о  наличии  синдрома  «метаболической  интоксикации».  Установленные  нарушения  связаны  с  накоплением  в  организме  больных  ХНБ  продуктов  патологического  метаболизма,  дефектом  обменных  процессов,  интенсивным  распадом  белков,  активацией  процессов  пероксидации  липидов  на  фоне  истощения  антиоксидантного  потенциала  крови,  гипоксии,  расстройств  микрогемодинамики,  что  приводит  к  разобщению  окислительного  фосфорилирования,  переключением  энергетического  метаболизма  на  менее  эффективный  путь  анаэробного  гликолиза  и  падением  энергетического  заряда  клеток.  Накопление  токсических  метаболитов  расстраивает  обмен  веществ,  способствует  развитию  иммунных  нарушений,  в  связи  с  накоплением  в  организме  веществ,  негативно  влияющих  на  обменные  процессы  непосредственно  внутри  клеток,  в  первую  очередь  тех,  для  которых  характерен  активный  метаболизм,  в  том  числе  многих  иммунокомпетентных  клеток. 

Заключение 

У  обследованных  больных  ХНБ  в  фазе  ремиссии  установлен  синдром  эндогенной  интоксикации,  соответствующий  среднему  уровню.  Интоксикация  проявляется  в  увеличении  общего  уровня  СМ,  содержания  пептидов  и  нуклеотидов,  в  возрастании  содержания  токсической  фракции  СМ,  преобладании  продуктов  распада  белков,  содержащих  ароматические  аминокислоты.  При  ХНБ  выявлено  повышение  общего  уровня  ЦИК,  что  является  признаком  воспалительного  процесса.  Накопление  преимущественно  крупных  молекул  ЦИК  —  показатель  стационарной  стадии  заболевания.

Список  литературы:

1. Власов  А.П.,  Крылов  В.Г.,  Григорьева  Т.И.  и  др.  Коррекция  синдрома  эндогенной  интоксикации  при  остром  панкреатите  //  Хирургия.  Журнал  имени  Н.И.  Пирогова:  научно-практический  журнал.  —  2010.  —  №  5.  —  С.  60—64.
2. Карякина  Е.В.,  Белова  С.В.  Молекулы  средней  массы  как  интегральный  показатель  метаболических  нарушений  (обзор  литературы)  //  Клиническая  лабораторная  диагностика.  —  2004.  —  №  3.  —  С.  3—8.
3. Малахова  М.Я.  Эндогенная  интоксикация  как  отражение  компенсаторной  перестройки  обменных  процессов  в  организме  //  Эфферентная  терапия.  —  2000.  —  Т.  6.  —  №  4.  —  С.  3—14.
4. Пат.  2415430  Российская  Федерация,  МПК  G  01  №  33/52.  Способ  определения  циркулирующих  иммунных  комплексов  /  Немов  В.В.,  Попкова  М.И.;  патентообладатель  Нижегородский  науч.-исслед.  ин-т  эпидемиологии  и  микробиологии  имени  академика  И.Н.  Блохиной.  №  2009137445/15;  заявл.  09.10.09;  опубл.  27.03.11,  Бюл.  №  9.
5. Чернушенко  Е.Ф.,  Фещенко  Ю.И.,  Круглова  И.Ф.  и  др.  Варианты  нарушений  иммунного  статусу  у  больных  хроническим  бронхитом  //  Укр.  пульмонол.  журн.  —  2000.  №  1.  —  С.  12—15.
6. Чучалин  А.Г.  Болезни  органов  дыхания  и  табакокурение  //  Терапевтический  архив.  —  2009.  —  №  3.  —  С.  5—9.
7. Юдакова  О.  В.,  Григорьев  Е.В.  Интенсивность  перикисного  окисления  липидов  и  антиоксидантная  активность,  уровень  молекул  средней  массы  как  показатели  эндогенной  интоксикации  при  распространенном  перитоните  //  Клиническая  лабораторная  диагностика.  —  2004.  —  №  10.  —  С.  20—22.
8. Cole  D.S.,  Morgan  B.P.  Beyond  lysis:  how  complement  infuences  cell  fate.  //  Clinical  Science.  —  2003.  —  Vol.  104.  —  P.  455—466.
9. Lenz  A.,  Franklin  G.A.,  Cheadle  W.G.  Systemic  inflammation  after  trauma  //  Injury.  —  2007.  —  Vol.  38.  —  Р.  1336—1345.