ИЗУЧЕНИЕ ВИДОСПЕЦИФИЧНОСТИ САЛЬМОНЕЛЛЕЗНОГО БАКТЕРИОФАГА В ОТНОШЕНИИ ПАТОГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ И НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ КИШЕЧНИКА ЧЕЛОВЕКА

В настоящее время появились положительные результаты при проведении работ по индикации и индификации возбудителей некоторых заболеваний с помощью бактериофагов [1, с. 44]. Методы фагодиагностики являются специфичными, не требующими больших затрат времени, материалов привлекательна доступность этих подходов  для лабораторий всех уровней [3, с. 85].

Данный метод лежит в основе современного направления биотехнологии [2, с. 256], что является актуальным в производстве современных противобактериальных препаратов, альтернативных антибиотикам [4, с. 121].

Цель работы: изучение видоспецифичности сальмонеллезного бактериофага в отношении патогенной микрофлоры и нормальной микрофлоры кишечника человека.

Задачи исследования:

1. Определить видоспецифичность сальмонеллезного бактериофага в отношении патогенной микрофлоры.
2. Определить видоспецифичность сальмонеллезного бактериофага в отношении нормальной микрофлоры кишечника.

Материалы и методы.

В своих исследованиях мы использовали «бактериофаг сальмонеллезный», который используются в медицинских учреждениях для лечения инфекционных болезней людей.

Тест-объектами служили: патогенные микроорганизмы –Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis и Escherichia coli; микроорганизмы нормальной микрофлоры кишечника человека – Lactobacillus fermenrum и Bifidobacterium bifidum.

Бактериологические исследования проводили согласно «Методическим указаниям по определению видоспецифичности бактериофагов»

Результаты исследования.

В работе применяли 24-часовые культуры Salmonella enteritidis, Escherichia coli и Staphylococcus aureus, выращенные на МПА. Чистоту культуры устанавливали в мазках, окрашенных по методу Грамма.

Определение видоспецифичности сальмонеллезного бактериофага на жидкой питательной среде. Метод основан на внесении сальмонеллезного бактериофага в бульон (титр 10^-1), засеянный одной и той же дозой различных культур микроорганизмов (в том числе и гомологичной бактериофагу, с целью получения феномена бактериофагии). Четырнадцать пробирок по 4,5 мл стерильного мясопептонного бульона, ставили в штатив и подписывали. 12 пробирок расставляли в 3 ряда по 4 пробирки в каждом. В 3 первые пробирки каждого опытного ряда добавляли сальмонеллезный бактериофаг в количестве 0,5 мл. Содержимое пробирок перемешивали с помощью вортекса, вносили по 0,05 мл (1 капля) взвеси смыва суточных агаровых культур: в первый ряд пробирок Salmonella enteritidis; во второй ряд пробирок – Escherichia coli и в третий ряд пробирок – Staphylococcus aureus. Четвёртые пробирки каждого ряда служили контролем культуры (КК), содержали 5 мл бульона и 1 каплю (0,05 мл) культуры Salmonella enteritidis, Escherichia coli и Staphylococcus aureus соответственно. Помимо этого в опыте находились ещё две контрольные пробирки: контроль (КБ) на стерильность бульона (в пробирке находилось 5 мл бульона без добавления бактерий и бактериофага) и контроль (КФ) бактериофага на стерильность (в пробирке находилось 4,5 мл бульона и 0,5 мл сальмонеллезного бактериофага). Штатив с пробирками помещали в термостат при температуре 37⁰С на 24 часа, после чего учитывали результат. Учет результатов обязательно начинали с контролей. Содержимое пробирок КК – стало мутным (произошло размножение бактерий). Этот контроль позволяет сделать вывод, что взятые в опыт культуры жизнеспособны, и что питательная среда обеспечивает их развитие в данных условиях опыта. Содержимое в пробирке с контролем бактериофага осталось прозрачным (посуда, бульон и бактериофаг стерилен). Результаты исследований показывают, что лизис культуры произошел только в ряду пробирок, в бульон которых вносили культуру Salmonella enteritidis и сальмонеллезный бактериофаг (содержимое пробирок прозрачно).

В остальных пробирках опытных рядов, в которые вносили культуры Escherichia coli и Staphylococcus aureus, произошел их рост (наблюдается помутнение бульона).

Определение видоспецифичности сальмонеллезного бактериофага на плотной  питательной среде. Чашки Петри с мясо-пептонным агаром засеяли равномерным сплошным посевом суточных культур бактерий Salmonella enteritidis, Escherichia coli и Staphylococcus aureus. Для инокуляции приготовленных чашек с агаром использовали стерильные ватные тампоны. Тампон погружали в стандартную суспензию микроорганизмов, затем избыток инокулюма удаляли, отжав тампон о стенки пробирки. Инокуляцию проводили штриховыми движениями в трех направлениях, поворачивая чашки Петри на 60⁰С. Спустя 5-10 минут после посева на каждую чашку вносили по 0,1 мл сальмонеллезного бактериофага. Чашки Петри помещали в термостат и инкубировали при температуре 37⁰С в течение 24 часов. После окончания инкубации чашки помещали на темную матовую поверхность так, чтобы свет падал на них под углом в 45⁰ (учет в отраженном свете). На МПА во всех чашках наблюдалась задержка роста бактерий (полный лизис) Salmonella enteritidis, Escherichia coli и Staphylococcus aureus, в местах внесения сальмонеллёзным бактериофагом.

По результатам исследования можно сделать вывод, что данный сальмонеллёзный бактериофаг не обладает строгой видоспецифичностью.

Видоспецифичность сальмонеллезного бактериофага в отношении микроорганизмов нормальной микрофлоры кишечника человека определяли следующим образом.

МПБ. Взяли 14 стерильных пробирок(8 опытных и 6 контрольных), в которых находилось по 4,5 мл мясо-пептонного бульона (МПБ). Пробирки поставили в штатив и подписали. В качестве контролей служили: «КМ» (контроль микроорганизма на его жизнеспособность), «КФ» (контроль фага), «КБ» (контроль бульона на стерильность). В первой и пятой пробирке вносили по 0,5 мл сальмонеллезного бактериофага, такое же количество что и в «КФ». В третью и седьмую пробирку вносили по  0,5 мл бактериофага кишечной палочки, в «КФ» аналогично. Во все пробирки, кроме «КБ» и «КФ» вносили по 1 капле взвеси в первом ряду пробирок живых лактобактерий. Во втором ряду пробирок все аналогично первому, только лактобактерин мы заменили бифидобактерином. Пробирки встряхивали на Vortex и помещали в термостат на 24 ч при t 37^oC, после чего учитывали результат.

Учет результатов исследования на МПБ. Пробирки в которые мы вносили бифидо- и лактобактерин произошло размножение бактерий (помутнение питательной среды). Это позволило сделать нам вывод, что взятый нами опытные культуры Lactobacterium и Bifidumbacterium были жизнеспособны. Питательная среды обеспечила их развитие в данных условиях опыта. Пробирка с «КФ» осталась прозрачной. Рост культуры произошел в пробирках первого и второго опытных рядов.

МПА. Взяли восемь стерильных чашек Петри с мясо-пептонным агаром, засеяли равномерным сплошным посевом суточной культуры Lactobacterium и Bifidumbacterium. Спустя 5-10 минут после посева, добавили по 0,1 мл бактериофаги: сальмонеллезный, стафилококковый, кишечной палочки. Чашки Петри поставили в термостат при t 37^oC на 24 ч, после чего учитывали результат.

Учет результатов на МПА. Во всех чашках Петри наблюдали обильный и сплошной рост культур Lactobacterium и Bifidumbacterium по всей поверхности.

Выводы

1. Результаты исследования по совместному культивированию бактериофага и патогенных микроорганизмов показали, что сальмонеллезный бактериофаг не обладает строгой видоспецифичностью.
2. При совместном культивировании бактериофага и микроорганизмов нормальной микрофлоры кишечника человека установили, что сальмонеллезный бактериофаг не действуют на данные микроорганизмы.

Список литературы:

1. Ганюшкин В.Я. Вопросы ветеринарной микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно – санитарной экспертизы / Сборник научных работ УСХИ. ‒ Ульяновск, 1990. – 85 с.
2. Джей Дж. М. Современная пищевая микробиология / Дж. М. Джей, М. Дж. Лёсснер, Д.А Гольден ; пер. 7-го анг. Изд – М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2012. – 886 с.
3. Заикина Е.Н. Лечебно-профилактическая эффективность ципрофлоксацина и бактериофага при эксперементальном колибактериозе цыплят / Е.Н. Заикина, В.Н. Скворцов // Актуальные проблемы науки в агропромышленном комплексе. – Кострома, Костромская ГСХА, 2015. ‒ 147 с.
4. Ковязина Н.А. Разработка твердых лекарственных форм на основе комплексных поливалентных препаратов бактериофагов / Н.А. Ковязина, А.В. Казьянин, А.М. Николаева, Е.В. Функнер // Материалы международной научно-практической конференции «Бактериофаги: Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности».  ‒ Ульяновск: УГСХА им. П.А. Столыпина, 2013. ‒ 186 с.