ИЗУЧЕНИЕ  ДИНАМИКИ  ЧИСЛЕННОСТИ  LISTERIA  MONOCYTOGENES  В  АССОЦИАЦИИ  С  ОВОЩНЫМИ  КУЛЬТУРАМИ

Овод  Артем  Артурович

студент  5  курса,  кафедра  экологии  РГАУ-МСХА  им.  К.А.  Тимирязева,  г.  Москва

E-mail:  belosom@rambler.ru

Годова  Галина  Владимировна

научный  руководитель,  канд.  биол.  наук,  доцент  РГАУ-МСХА  им.  К.А.  Тимирязева,  г.  Москва

Пушкарева  Валентина  Ивановна

научный  руководитель,  д-р  биол.  наук,  ведущий  научный  сотрудник  НИИЭМ  им.  Н.Ф.  Гамалеи,  г.  Москва

Данная  работа  была  выполнена  при  поддержке  гранта  №  11G34.310079  правительства  РФ.

Установлено,  что  овощные  растения  могут  служить  эконишей  для  патогенных  микроорганизмов  [1].  Поскольку  естественным  первичным  природным  резервуаром  патогенных  форм  считается  почва  [4],  существует  опасность  проникновения  патогенов  в  растительные  субстраты.  Источником  заражения  сельскохозяйственных  животных  служат  корма,  в  частности,  силос,  где  листерии  активно  размножаются.  Инфицирование  людей  связано  с  употреблением  в  пищу  контаминированных  овощей  и  продуктов  животноводства  [3].

Следует  отметить,  что  в  последние  годы  интерес  к  данной  проблеме  возрастает:  это  связано,  прежде  всего,  с  глобализацией  экономики,  что  обусловливает  трансконтинентальное  перемещение  огромных  объемов  овощей,  фруктов,  других  продуктов  по  водным,  воздушным,  наземным  путям  и  возможное  распространение  возбудителей  пищевых  инфекций  не  только  в  страны  с  низким  уровнем  санитарно-эпидемиологического  и  ветеринарного  контроля,  но  и  в  благополучные  по  этим  параметрам  государства.

Современная  пищевая  индустрия  направлена  на  внедрение  новых  технологий  и  новых  продуктов,  которые  приводят  к  изменению  пищевого  поведения  населения,  к  отказу  от  национальных  традиций  в  пользу  так  называемого  биогенного  питания,  а  также  внедрение  вегетарианства,  фаст-фуда,  введение  в  рацион  проростков  ряда  агрокультур:  люцерны,  бобов,  клевера,  редиса,  а  также  других  растений,  не  подвергающихся  тепловой  обработке,  которые  наряду  с  привычными  овощными  культурами  занимают  все  больший  удельный  вес  в  питании  современных  жителей  городов.  Следствием  структурных  изменений  в  рационе  является  возникновение  вспышек  пищевых  токсикоинфекций,  часто  неясной  этиологии,  которые  всегда  носят  резонансный  характер  и  нередко  остаются  нерасшифрованными,  с  не  выявленными  резервуарами  и  источниками  возбудителя  [5].

Цель  данной  работы:  определить  динамику  численности  листерий  (вирулентного  штамма  EGD  и  аттенуированного  —  Δhly)  в  ассоциации  с  каллусами  листового  салата  (Lactuca  sativa  L.),  пекинской  капусты  (Brassica  pekinensis)  и  петрушки  (Petroselinum  crispum).

Для  получения  стерильных  эксплантов  из  семян  листового  салата,  пекинской  капусты  и  петрушки  использовалась  сулема  —  дихлорид  ртути,  который  применяется  как  антисептик,  для  протравливания  семян.  После  чего  семена  промывали  стерильной  водой  и  высевали  на  питательную  среду  MS    [2]  После  прорастания  семян  и  получения  проростков  выращивали  каллусы  по  общепринятой  методике  [2].  Каллусы  всех  растений  выращивали  в  климат-камере  при  влажности  воздуха  70  %,  освещенности  5000  люкс  и  температуре  25  ºС.

Заражение  каллусов  для  бактериологических  исследований  проводили  с  помощью  шприца,  вводя  бактериальную  суспензию  в  агар  под  каждый  каллус  в  дозе  10⁶  м.к./мл  (по  оптическому  стандарту  мутности  —  National  opacity  standard).  В  качестве  контроля  оставляли  каллусы,  под  которые  вводили  по  1,0  мл  изотонического  раствора  NaCl.  Посевы  исследовали  в  динамике  (через  1—3-5—7  суток  после  заражения  клеточных  культур)  путем  высева  суспензии  из  гомогенизированных  в  изотоническом  растворе  хлористого  натрия  каллусов  (Disperser  T  10  basic  IKA,  Germany)  на  селективную  среду  для  количественного  учета  листерий  по  КОЕ.

Бактериологические  исследования  каллусов  листового  салата  в  первые  сутки  после  заражения  выявили  следующее:  листерии  штамма  EGD,  также  как  и  его  изогенного  мутанта  проникали  в  растительные  ткани  и  их  концентрация  была  практически  одинаковой  —  6,8  lg  КОЕ  (рис.  1).

Рисунок  1.  Численность  L.monocytogenes  в  ассоциации  с  листовым  салатом,  25  С

Косвенным  свидетельством  колонизации  является  то,  что  листерии  изолировали  только  из  гомогената  тканей,  тогда  как  смывы  с  поверхности  образцов  не  содержали  искомых  бактерий,  а  лишь  незначительное  количество  грибов  (Penicillim  sp.  и  Candida  sp.),  что  расценивалось  как  естественная  поверхностная  контаминация.  Каллусы  не  изменяли  цвета  и  выглядели  как  интактные  растения.  Начиная  с  3-их  суток,  каллусы,  зараженные  L.monocytogenes  EGD,  останавливались  в  росте  и  желтели;  при  этом  численность  листерий  оставалась  высокой  —  10⁷  КОЕ/г.  Образцы,  зараженные  аттенуированными  листериями  сохраняли  нормальный  внешний  вид,  однако  при  посевах  гомогената  отмечена  столь  же  высокая  численность  бактерий  —  10⁷  КОЕ/г.  Через  неделю  каллусы,  зараженные  L.monocytogenes,  представляли  собой  мацерированные  ткани,  практически  распавшиеся;  напротив,  каллусы,  инфицированные  авирулентными  листериями  в  эти  сроки  не  испытывали  видимого  фитопатогенного  воздействия  на  растительные  ткани,  при  этом,  сохранялась  прежняя  численность  бактерий  —  10⁷  КОЕ/г.

Популяционная  динамика  листерий  изогенных  штаммов,  взаимодействующих  с  каллусами,  показала,  что  микроорганизмы  хорошо  размножались  в  ассоциации  с  живыми  растительными  клетками,  однако  при  гибели  каллусов,  зараженных  L.monocytogenes  EGD,  их  концентрация  не  менялась,  очевидно,  бактерии  использовали  распавшиеся  ткани  в  качестве  питательного  субстрата.

Контрольные  каллусы  сохраняли  первоначальный  вид:  при  просмотре  на  световом  микроскопе  при  увеличении  х1600  были  отмечены  большие  клетки  округлой  формы,  плотно  прижатые  друг  к  другу,  сильно  вакуолизированные  и  оводненные,  имеющие  мелкое  ядро  и  не  содержащие  хлорофилла.

Аналогичные  опыты,  проведенные  на  модели  пекинской  капусты  выявили  сходную  динамику  роста  как  вирулентного,  так  и  аттенуированного  штаммов  листерий  в  ассоциации  с  растительными  клетками  (рис.  2).

Рисунок  2.  Численность  L.monocytogenes  в  ассоциации  с  пекинской  капустой,  25  С

При  взаимодействии  с  каллусами  петрушки  численность  листерий  в  течение  недели  уменьшалась,  постепенно  —  в  случае  использования  штамма  EGD,  а  при  инфицировании  растительных  клеток  L.monocytogenes  Δ  hly,  который  лишен  гена  патогенности  листериолизина  О,  наблюдалось  резкое  снижение  численности  бактерий  —  практически  до  нуля  (рис.  3).  Снижение  численности  может  быть  связано  с  проявлением  фитонцидных  свойств  петрушки,  содержащей  эфирные  масла,  обеспечивающие  защитный  механизм  при  внедрении  бактерий  в  растительные  клетки. 

Рисунок  3.Численность  L.monocytogenes  в  ассоциации 

с  петрушкой,  25  °С

Культуральные,  морфологические  и  биохимические  свойства  изолятов  листерий,  полученных  в  ходе  экспериментов,  не  изменялись;  лишь  скорость  роста  культур  после  посевов  замедлялась  до  48  часов. 

Таким  образом,  популяционная  динамика  инфицированных  каллусов  разных  моделей  выявила  различия  между  штаммами  EGD  и  Δhly  в  ассоциации  с  петрушкой,  фитонцидные  свойства  которой  существенно  снижают  численность  аттенуированного  штамма.

Список  литературы:

1.Годова  Г.В.,  Пушкарева  В.И.  и  др.  Овощные  культуры  как  возможные  резервуары  листерий  //  Известия  ТСХА.  2009.  №  4.

2.Калашникова  Е.А.,  Кочиева  Е.З.,  Миронова  О.Ю.  Практикум  по  сельскохозяйственной  биотехнологии.  //  2006,  М:  Колос,  —  154  с.

3.Литвин  В.Ю.,  Гинцбург  А.Л.,  Пушкарева  В.И.  и  др.  Эпидемиологические  аспекты  экологии  бактерий.//  М:  Фармарус-принт,  1998,  —  257  с.

4.Пушкарева  В.И.  Патогенные  бактерии  в  почвенных  и  водных  сообществах.  Дисс..докт.  биол.  наук.  М.  1994,  —  220  с.

5.Пушкарева  В.И.,  Литвин  В.Ю.,  Ермолаева  С.А.  Растения  как  резервуар  и  источник  возбудителей  пищевых  инфекций.  //  Эпидемиология  и  вакцинопрофилактика  .—  2012.  —  №  2.  —  С.  10—20.