РОЛЬ  ОПРЕДЕЛЕНИЯ  AZF-ФАКТОРА  В  АЛГОРИТМЕ  КОМПЛЕКСНОГО  ОБСЛЕДОВАНИЯ  И  ЛЕЧЕНИЯ  ТЯЖЕЛЫХ  ФОРМ  МУЖСКОГО  БЕСПЛОДИЯ

Машкин  Анатолий  Игоревич

Филимоненкова  Вероника  Юрьевна

студенты  417  группы  лечебного  факультета  БГМУ,  г.  Минск

E-mail: 

Юшко  Евгений  Иванович

научный  руководитель,  канд.  мед.  наук,  доцент  кафедры  Урологии,  Белорусский  Государственный  Медицинский  Университет,  г.  Минск

Около  14,5  %  супружеских  пар  в  Беларуси  бесплодны.  Инфертильность  по  мужскому  фактору  составляет  35—40  %.  Структура  мужского  бесплодия  следующая:  воспалительные  заболевания  гениталий  —  19,3  %,  эндокринные  нарушения  —  15,3  %,  недоразвитие  гениталий  —  0,2  %,  генетические  нарушения  —  0,6  %,  врожденные  пороки  развития  —  0,2  %,  сочетание  нескольких  факторов  —  2,4  %,  причина  не  установлена  —  30,1  %,  в  стадии  обследования  —  31,9  %.  В  ряде  случаев  бесплодие  обусловлено  азооспермией,  которая  выявляется  у  4—6  %  [1,  6]  инфертильных  мужчин.

Принято  различать  2  основных  типа  азооспермии:  необструктивную  (секреторное  бесплодие)  и  обструктивную  (экскреторное  бесплодие).  Необструктивная  азооспермия  связана  с  различными  нарушениями  сперматогенеза,  при  этом  семявыносящие  пути  остаются  проходимыми.  В  эякуляте  могут  выявляться  клетки-предшественницы  (сперматоциты,  сперматиды  и  др.).  Как  правило,  факторами,  приводящими  к  необструктивной  азооспермии  являются  эндокринные  нарушения,  недоразвитие  гениталий,  генетические  нарушения  (микроделеции  AZF  (Azoospermia  Factor)  локуса  Y  хромосомы,  мутация  гена  муковисцидоза).

Одной  из  наиболее  тяжелых  патологий,  вызывающих  азооспермию,  являются:  хромосомный  дисбаланс,  мутации  на  хромосомном  или  генном  уровне.  Мутации  генов,  контролирующих  этапы  сперматогенеза,  могут  приводить  к  блоку  сперматогенеза,  проявляясь  в  диапазоне  от  легкого  снижения  сперматогенной  активности  до  полного  отсутствия  половых  клеток  в  семенных  канальцах  (синдром  «только  клетки  Сертоли»),  нарушению  подвижности,  морфологических  и  фертильных  свойств  сперматозоидов.  Примером  подобной  патологии  являются  микрододелеции  AZF  локуса  Y  хромосомы.

Микроделеция  Y  хромосомы  —  это  выпадение  определенных  участков  Y  хромосомы  —  AZF  локуса  (фактора  азооспермии).  AZF  локус  находится  в  длинном  плече  Y-хромосомы  (q11).  Гены,  расположенные  в  этом  локусе,  играют  важную  роль  в  процессе  сперматогенеза.  Микроделеции  локуса  AZF  [9—12]  хромосомы  Y  обнаруживаются  в  среднем  в  10—15  %  случаев  азооспермии  и  в  5—10  %  случаев  олигозооспермии  тяжелой  степени  [7]  и  обусловливают  нарушения  сперматогенеза  и  бесплодие  у  мужчин.  AZF-локус  содержит  три  неперекрывающихся  субрегиона:  AZFa,  AZFb  и  AZFc  [6].  Каждый  из  них  содержит  ряд  кандидатных  генов  [13],  мутации  которых  приводят  к  азооспермии  или  олигозооспермии  тяжелой  степени.  Делеции  AZFa-  и  AZFb-субрегионов  ассоциированы  с  невозможностью  получения  зрелых  половых  клеток,  тогда  как  у  пациентов  с  утратой  субрегиона  AZFc  примерно  в  71  %  случаев  удается  получить  зрелые  сперматозоиды.  У  пациентов  с  нормозооспермией  в  некоторых  случаях  так  же  отмечено  обнаружение  делеций,  захватывающих  AZFc-субрегион.  У  мужчин  с  AZF-микроделециями  часто  отмечается  прогрессирование  нарушений  сперматогенеза  в  связи  с  чем,  таким  пациентам  показана  криоконсервация  полученных  сперматозоидов.

Обследование  пациентов  с  азооспермией  и  олигозооспермией  тяжелой  степени  в  отношении  состояния  AZF  локуса  Y  хромосомы  позволяет:  установить  генетическую  причину  нарушений  сперматогенеза;  проводить  дифференциальную  диагностику  бесплодия  у  мужчин;  корректировать  терапевтические  подходы,  избегая  «лишнего»  лечения;  прогнозировать  возможность  получения  сперматозоидов  для  ICSI  (introcytoplazmatic  sperm  injection,  интрацитоплазматическая  инъекция  сперматозоида);  прогнозировать  возможность  получения  сперматозоидов  при  тестикулярной  биопсии;  прогнозировать  для  потомства  мужского  пола  возможность  наследования  репродуктивных  проблем  отца;  информировать  супругов  о  возможности  использования  предимплантационной  диагностики  с  целью  определения  пола  и  переноса  эмбрионов  женского  пола  (после  проведения  ICSI),  для  исключения  наследования  репродуктивных  проблем  отца.

Таким  образом,  благодаря  использованию  такого  метода  вспомогательных  репродуктивных  технологий  (ВРТ),  как  ЭКО+ICSI,часть  пациентов,  имеющих  микроделеции  AZF  локуса  Y  хромосомы,  может  иметь  собственное  потомство.  Однако  следует  иметь  в  виду,  что  плоды  мужского  пола  будут  наследовать  Y-микроделеции.  Пациенты  должны  быть  информированы  для  принятия  решения  о  применении  ВРТ.  Поэтому  перед  планируемым  ЭКО  в  рамках  обследования  супружеской  пары  мужчинам  с  азооспермией  и  олигозооспермией  тяжелой  степени  необходимо  провести  молекулярно-генетический  анализ  Y-хромосомы.  Делеции  AZFa-  и  AZFb-субрегионов  ассоциированы  с  невозможностью  получения  зрелых  половых  клеток,  таким  образом,  проведение  диагностической  биопсии  у  данных  пациентов  не  оправдано.  Следовательно,  данным  пациентам  необходимо  рекомендовать  иные  пути  решения  репродуктивных  проблем:  донорские  программы  или  усыновление.  Наличие  AZF-микроделеций  обусловливает  неэффективность  консервативного  лечения,  направленного  на  повышение  сперматогенеза  (увеличение  количества  сперматозоидов),  однако  у  лиц  с  утратой  AZFс-субрегиона  при  подготовке  к  ВРТ  необходима  терапия,  направленная  на  коррекцию  гормонального  и  метаболического  статуса  мужчины  для  получения  морфологически  качественных  сперматозоидов.

Для  дифференциальной  диагностики  обструктивных  и  необструктивных  форм  мужского  бесплодия  используется  рентгенконтрастное  исследование  проходимости  семявыносящих  путей,  трансуретральная  катеттеризация  устья  семявыносящего  протока  и  др.  Конечным  этапом  является  использование  пункционной  биопсии.  Данная  процедура  носит  как  диагностический,  так  и  лечебный  характер,  т.  к.  при  наличии  в  биоптате  единичных  сперматозоидов  их  можно  в  дальнейшем  использовать  при  проведении  такого  метода  ВРТ  как  ICSI.  Существует  большое  разнообразие  методов  проведения  данной  процедуры,  однако,  на  наш  взгляд  наиболее  приемлемым  и  часто  используемым  является  TESA  (testicular  sperm  aspiration)  —  чрезкожная  аспирационная  биопсия  яичка,  в  связи  с  простотой  ее  выполнения  и  малоинвазивностью  [2,  3,  4].

Цели  и  задачи

Целью  данной  работы  стали  анализ  структуры  мужского  бесплодия  и  возможных  факторов  наступления  инфертильного  состояния  и  утяжеления  его  степени,  изучение  результатов  клинических  и  лабораторных  исследований  пациентов  с  необструктивной  азооспермией  и  оценкой  материала,  полученного  при  использовании  TESA  для  повышения  эффективности  диагностики  и  лечения  у  данной  категории  пациентов.

Задачи:

1.  Определить  группу  пациентов  нуждающихся  в  диагностике  генетических  факторов,  приводящих  к  мужскому  бесплодию.

2.  Определить  удельный  вес  пациентов  с  азооспермией  и  олигозооспермией  тяжелой  степени  имеющих  микроделеции  AZF  локуса  Y  хромосомы.

3.  Определить  категорию  пациентов  имеющих  делеции  разных  субрегионов  AZF-локуса  Y-  хромосомы  связанные  с  невозможностью  получения  зрелых  сперматозоидов.

4.  Определить  эффективность  диагностической  биопсии  ткани  яичка  в  качестве  лечебной  процедуры  для  проведения  ВРТ  (ЭКО,  ICSI).

Материалы  и  методы.

Объект  исследования  мужчины  с  азооспермией  или  олигозооспермией  тяжелой  степени.  Безусловно,  молекулярно-генетическое  исследование  необходимо  проводить  всем  мужчинам  перед  планируемым  ICSI.  Кроме  того,  исследование  AZF-локуса  на  наличие  микроделеций  выполнялось  у  мужчин  с  показателем  количества  сперматозоидов  менее  5  млн/мл.  [8].  Так  как  чаще  всего  микроделеции  обнаруживаются  у  мужчин  с  идиопатическим  бесплодием  (бесплодием  неясного  генеза),  то  им  в  первую  очередь  показано  обследование  AZF-локуса  на  наличие  микроделеций.  У  части  пациентов  с  микроделециями  Y-хромосомы  в  анамнезе  могут  быть  и  другие  (негенетические)  причины  нарушения  сперматогенеза,  такие  как  половые  инфекции,  варикоцеле,  крипторхизм,  которые  сами  по  себе  редко  приводят  к  столь  глубоким  нарушениям  сперматогенеза.

Проводимое  комплексное  обследование  включало  методы  рекомендованные  ВОЗ  для  диагностики  бесплодия  [5,  15],  а  при  оценке  результатов  за  стандарты  принимались  нормативные  показатели,  рекомендованные  ВОЗ  в  2001  г.  [14].

I.Клинические  методы:

1.Первичный  опрос  (сбор  анамнеза  и  изучение  представленной  медицинской  документации).

2.Общее  медицинское  обследование.

3.Обследование  мочеполовой  системы  (включая  пальцевое  ректальное  исследование  предстательной  железы  и  семенных  пузырьков).

4.Обследование  терапевтом,  генетиком,  сексопатологом  (по  показаниям).

II.Лабораторно-диагностические  методы:

1.Спермограмма  (минимум  дважды).

2.Общий  и  биохимический  анализ  крови,  общий  анализ  мочи.

3.Определение  титра  антиспермальных  антител  (по  показаниям).

4.Посткоитальный  тест.

5.Медико-генетическое  исследование  (исследование  кариотипа).

6.Микроскопическое  исследование  секрета  простаты  и  семенных  пузырьков.

7.Исследование  на  ИППП.

8.Гормональный  скрининг  (фолликулостимулирующий  гомон  (ФСГ),  лютеонизирующий  гормон  (ЛГ),  пролактин  (ПРЛ),  свободный  тестостерон  (Т),  17-эстрадиол  (Е2)).

9.Ультразвуковое  исследование  простатовезикулярного  комплекса  и  органов  мошонки  с  обязательным  определением  объема  яичек  и  исследованием  придатков.

10.Тестикулярная  биопсия  (TESA).

Результаты  и  их  обсуждение.

В  основу  работы  положены  результаты,  полученные  при  проведении  диагностики  и  лечения  тяжелых  форм  мужского  бесплодия  в  клинике  «Центр  репродуктивной  медицины»  г.  Минск,  Республика  Беларусь.

Диагноз  азооспермии  (тяжелой  олигозооспермии)  у  исследуемых  пациентов  устанавливался  на  основании  показателей  спермограммы,  а  проведение  комплексного  обследования  и  TESA  позволяло  подтвердить  данный  диагноз  и  уточнить  тип  азооспермии.

Всего  было  обследовано  на  микроделеции  AZF-субрегиона  423  пациента.

Из  них:  320  мужчин  с  азооспермией,  103  пациента  с  единичными  сперматозоидами  в  эякуляте.  Микроделеции  AZF  выявлены  у  22  человек  (5,2  %)  из  423  :  из  320  пациентов  с  азооспермией  —  у  18  человек  (5,62  %),  из  103  пациентов  с  единичными  сперматоцитами  —  у  4  (3,9  %).  При  оценке  гормонального  статуса  у  16  (88,9  %)  из  18  человек  с  азооспермией  ФСГ  превышал  12,  тестостерон  был  снижен  у  14  (77,7  %).

Делеция  локуса  AZF-c  наблюдалась  у  19  (4,5  %)пациентов  (из  них  у  15  пациентов  с  азооспермией  и  у  4  с  единичными  сперматозоидами  в  эякуляте),  делеция  AZFb  и  c  локуса  у  2  (0,5  %),  делеция  локуса  b  у  1  (0,2  %).

Процедура  ЭКО+ICSI  выполнялась  4  пациентам  из  22  с  единичными  сперматозоидами  в  эякуляте,  при  этом  в  2  (50  %)  случаях  наступила  беременность,  закончившаяся  срочными  родами  (родились  девочки).

Диагностическая  биопсия  по  методике  TESA  проводилась  18  пациентам  с  азооспермией  из  22,  у  которых  были  выявлены  делеции  AZF  субрегиона.  В  случае  сочетания  делеции  локусов  AZFb  и  c  (3  случая)  сперматозоиды  не  получены.  В  15  случаях  делеции  локуса  AZF-c  у  5  (33,3  %)  сперматозоиды  не  получены,  у  10  (66,7  %)  получены  единичные  сперматозоиды,  которые  подверглись  криоконсервации.  Процедура  ЭКО+ICSI  с  использованием  криоконсервированного  материала  проведена  8  пациентам  из  10  (2  проходят  подготовку).  В  3  (37,5  %)  случаях  наступила  беременность,  из  них  в  2  случаях  —  срочные  роды,  в  1  случае  —  спонтанный  аборт  в  7—8  недель.

Выводы.

1.  К  группе  пациентов,  нуждающихся  в  диагностике  генетических  факторов  инфертильности,  следует  отнести:  всех  мужчин  с  идиопатическим  бесплодием,  мужчин  с  азооспермией  и  тяжелыми  формами  олигозооспермии.

2.  Общее  количество  мужчин,  имеющих  делецию  AZF-локуса  Y-хромосомы  составило  22  (5,2  %)  человека  из  423  обследованных.

3.  Вероятность  отсутствия  сперматозоидов  при  проведении  биопсии  у  мужчин  с  делециями  AZFb  ,AZFb+c  составила  100%,  в  случаях  с  микроделецией  локуса  c  —  33,3  %

4.  Вероятность  наступления  беременности  при  проведении  ЭКО+ИКСИ  при  использовании  криоконсервированного  биоптата  у  мужчин  с  микроделециями  локуса  с  составила  37,5  %

5.  Исследование  микроделеций  AZF  локуса  Y-хромосомы  у  мужчин  с  тяжелой  формой  олигоспермии  и  азооспермии  является  важным  диагностическим  и  прогностическим  критерием,  определяющим  рациональную  тактику  лечения,  выбор  метода  преодоления  бесплодия  и  показаний  к  предимплантационной  диагностике  пола  потомства.

Список  литературы:

1. Корякин  М.В.  Анализ  причин  мужского  бесплодия/  Корякин  М.В.,  Акопян  А.С.//  Проблемы  репродукции.  2000.  №  5.  С.  68—74.
2. Кулаков  В.И.  Лечение  женского  и  мужского  бесплодия.  Вспомогательные  репродуктивные  технологии/  Кулаков  В.И.  [и  др.]//М.:  МИА,  2005.  —  592  с.
3. Леонов  Б.В.  Наш  опыт  применения  метода  интрацитоплазматической  инъекции  сперматозоида  в  программе  экстракорпорального  оплодотворения  и  переноса  эмбриона  в  полость  матки/  Леонов  Б.В.  [и  др.]//Акушерство  и  гинекология.  1999.  №  4.  С.  35—38.
4. Нишлаг  Э.  Андрология.  Мужское  здоровье  и  дисфункция  репродуктивной  системы./  Нишлаг  Э.,  Бере  Г.М.//  Пер.  с  англ.  МИА,  2005.
5. Тер-Авнесов  Г.В.  Мужское  бесплодие:  этиопатогенез,  диагностика  и  лечение/  Тер-Авнесов  Г.В.//Москва,  2007.  114  с.
6. Buffat  C.  ICSI  outcomes  in  obstructive  azoospermia:  influence  of  the  origin  of  surgically  retrieved  spermatozoa  and  the  cause  of  obstruction/  Buffat  C/[et  al.]//  Human  Reproduction  2006  №  21(4).  Р.  1018—1024.
7.  Krausz  C.,  McElreavey  K.Y  chromosome  and  male  infertility.  Frontiers  in  Biosince  1999;  4:  1—8.
8. Simoni  M.  et  al.  Laboratory  guidelines  for  molecular  diagnosis  of  Y-chromosomal  microdeletion.Intern  J  Andrology  1999;  22:  292—299.
9. Tiepolo  L.,  Zuffardi  O.  Localization  of  factors  controlling  spermatogenesis  in  the  non  fluorescent  portion  of  the  human  Y  chromosome  long  arm.  Hum  Genet  1976;  34:  119—124.
10. Vogt  P.H.,  Chandley  A.C.,  Hargreave  Т.В.  et  al.  Microdeletions  in  interval  6  of  the  Y  chromosome  of  males  with  idiopathic  sterility  point  to  disruption  of  AZF,  a  human  spermatogenesis  gene.  Hum  Genet  1992;  89:  491—496.
11. Vogt  P.H.,  Edelmann  A.,  Hirschmann  P.  et  al.  The  azoospermia  factor  (AZF)  on  the  human  Y  chromosome  in  Yqll:  function  and  analysis  in  spermatogenesis.  Reprod  Fertil  Dev  1995;  7:  685—693. 
12. Vogt  P.H.,  Edelmann  A.,  Kirsh  S.  et  al.  Human  Y  chromosome  azoospermia  factors  (AZF)  mapped  to  different  subregions  in  Yql1.  Hum  Mol  Genet  1996;  5:  933—943.
13. Vogt  P.H.  Human  chromosome  deletions  in  Yq11,  AZF  candidate  genes  and  male  infertility:  history  and  update.  Mol  Hum  Reprod  1998;  4:  739—744.
14. World  Health  Organization.  Laboratory  manual  for  the  examination  of  human  semen  and  sperm-cervical  mucus  interaction.  Cambridge  University  Press.  Cambridge.  2001.
15. World  Health  Organization.  Manual  for  the  standardized  investigation  and  diagnosis  of  the  infertile  couple.  Cambridhe  University  Press,  Cambridge,  1993.