СОЗДАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДОЗОЗАВИСИМОГО ЛИЗИСА ТРОМБА

Известно, что тромбозы ежегодно в мире уносят жизни почти 25 млн человек. Длительный лизис и фагоцитоз тромба сопровождается разрастанием соединительной ткани, коллагенизацией, вызывает нарушение кровотока и трофики тканей [1].

Изучение веществ, создание новых лекарственных препаратов, способных вызывать лизис тромба и восстановление кровотока требует наличия доступного способа для быстрой оценки их тромболитического действия.

Цель исследования - разработать и оценить дозозависимые эффекты лизиса тромба в экспериментальной тест-системе.

Задачи:

Материалы и методы. В работе использовали 10 крыс-самцов линии Wistar массой 280-300 г. Все животные содержались при естественном освещении на стандартном рационе при свободном доступе к корму и воде.

Для исследования тромболитической эффективности Тромбовазима животным под эфирным наркозом из хвостовой вены набирали кровь в 2 мл эппендорфы, где происходило дальнейшее формирование тромбов стандартных размеров в течение 24 ч.

Далее образовавшийся тромб разрезали на Alto на фрагменты толщиной 0,8 мм и помещали в стандартные планшетные 96 луночные кюветы. Полученные образцы погружали в фосфатно-солевой буфер (раствор Кребса-Хензелейта) с pH 7,4. В раствор добавляли препарат Тромбовазим до конечной концентрации 0.6, 1.2, 2.4 и 4.8 ЕД/мл и инкубировали образцы при температуре 37°С.

В процессе исследования во временные интервалы 0 - 60 мин определяли площадь тромба путем сканирование каждые 30 мин. В контрольных экспериментах проводили аналогичные манипуляции, но без добавления препарата.

В процессе статистической обработки считали средние арифметические значения, достоверность рассчитывали непараметрическим методом Манна-Уитни для малых выборок (p<0,05).

Результаты и их обсуждение. Для определения наиболее подходящего временного диапазона лизиса тромба и высоты виалы мы взяли раствор Тромбовазима с концентрацией 2,4 ЕД/мл [2].

Изначально использовалась стандартная виала – высокая. В результате потеря в площади тромба к 30 минутам инкубации в растворе Тромбовазима составила 20,65 % (p<0,05) (рис. 1). К 60 мин этот показатель снизился еще 11,05 %.

При использование низкой виалы (стандартная виала уменьшенная по высоте в 2 раза) с такой же концентрацией препарата (2,4 ЕД/мл), было получено (рис. 2), что площадь тромба к 30 мин уменьшилась в 2 раза (p<0,05). К 60 мин регистрируется еще небольшое снижение до уровня 45,5 %.

Таким образом в эксперименте на основании наибольшей потери площади тромба было установлено, что наивысшая тромболитическая активность в при добавлении раствора Тромбовазима с концентрацией 2,4 ЕД/мл приходится на 30 минуту инкубации в низкой виале - 50,1%. Поэтому далее для в работе будет использована низкая виала с диапазоном в 30 мин.

Рисунок 1. Площадь тромба в высокой виале при добавлении Тромбовазима 2,4 ЕД/мл во временном диапазоне 0-60 минут

Рисунок 2. Изменение площади тромба в низкой виале при инкубации с Тромбовазимом

При этом в контрольной группе без добавления препарата (использовался только раствор Кребса-Хензелейта) площадь тромба за тот же интервал времени увеличилась на 0,3 % (рис. 3). Данный феномен связан с чрезмерной плотностью суточного тромба, при инкубации он начинает поглощать раствор и временно увеличивается в объеме.

Далее мы определяли влияние концентрации препарата на степень тромболитической активности (рис. 4). Инкубируя фрагменты суточного тромба в растворах с Тромбовазимом, было получено дозозависимое влияние. Так, при концентрации препарата 0.6, 1.2, 2.4 и 4.8 ЕД/мл площадь тромба снизилась (рис. 4) за полчаса на 1.95 %, 20.61 %, 50.1 % и 84.15 % соответственно (p<0,05).

Таким образом, в ходе исследования разработан простой и эффективный метод определения тромболитической активности in vitro. Результаты данного исследования могут быть использованы для определения активности прямых фибринолитиков, а также для уточнения фармакокинетических параметров препарата Тромбовазим уже не по косвенной протеолитическойактивности, а по прямой фибринолитической [3]. Разработанный метод прост в воспроизведении, не требует специализированного дорогостоящего оборудования и обладает высокой чувствительностью, которая в 28 раз превосходит традиционный метод определения – спектрофотометрический.

Рисунок 3. Площадь тромба в низкой виале без добавления препарата

Рисунок 4. Влияние концентрации препарата на степень тромболитической активности

Выводы:

1. Создана экспериментальная тест-система для изучения лизиса тромбов;
2. Определен наиболее подходящий диапазон инкубации суточного тромба крыс - 30 мин.;
3. Определена зависимость изменения площади тромба от концентрации Тромбовазима.

Список литературы:

1. Бокарев И.Н., Попова Л.В. Тромбозы артерий и вен: что делать? / Вестник международной академии наук (русская секция). - 2009. №1 - С. 6-10.
2. Мишенина С.В. Тромболитическое действие лекарственного препарата на экспериментальных моделях / Мишенина С.В., Ершов К.И., Мадонов П.Г., Байкалов Г.И. / Сибирский научный медицинский журнал. - 2017. Т. 37. №3. - С. 27-31.
3. Плотников М.Б. Антитромботический и тромболитический эффекты нового отечественного протеолитического препарата Тромбовазима // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. Т. 147. №4. - С. 418-421.