УРЕАЗА – ЭЛЕКСИР ЖИЗНИ ИЛИ НЕЧИСТАЯ СИЛА

В настоящее время одним из перспективных направлений в биотехнологии является получение промышленных ферментных препаратов и их разностороннее использование. Надо отметить, что ферменты все шире применяют для аналитических целей, т.е. при помощи ферментов можно проводить качественные реакции, и выявлять различные патологии. Например, фермент уреазу используют для качественного определения мочевины в различных биологических жидкостях, например, в слюне, крови и других [1, c. 57]. Фермент уреаза, согласно Международной классификации ферментов, относится к третьему классу ферментов - класса гидролаз, подклассу амидаз, подподкласс карбамидаз, кодовый номер фермента уреазы 3.5.1.5 [2].

1.1 Экологическая роль фермента уреазы.

Если бы в окружающей среде отсутствовали процессы деградации, разрушения мочевины, гидросфера Земли очень быстро была бы перенасыщена эти азотистым шлаком. Однако в природе (почве, воде и т.п.) присутствуют микроорганизмы, способные вырабатывать фермент, активно гидролизирующий поступающую мочевину. Этот фермент называется уреазой, выполняет поистине глобальную роль, катализируя реакцию [6, c. 88]:

CO(NH2)2 + H2 O ®2 NH3 +CO2

Эту реакцию можно рассматривать как процесс экологической минерализации органического азотистого шлака; в результате этого процесса водорастворимый нелетучий органический субстрат – мочевина в результате данной реакции трансформируется в летучие продукты – аммиак и диоксид углерода. Впрочем, надо заметить, что основная масса образовавшихся продуктов не улетучивается, а в нейтральной среде воды и почвы взаимодействует между собой с образованием преимущественно гидрокарбоната аммония. Последний усваивается растениями и микроорганизмами.

По способности ускорять реакцию гидролиза мочевины уреазу можно отнести к суперэффективным катализаторам, поскольку она снижает энергию активации реакции со 137 кДж/моль до 46 кДж/моль, что соответствует ускорению в 1014 раз. Другими словами, то количество мочевины, которое при участии уреазы разлагается за 1 минуту, в отсутствии последней потребуется за почти 2000 лет [3, c. 45-73]. При этом достаточно большое количество аммонийного азота трансформируется ферментами почвенных микроорганизмов с образованием окисленных форм азота: N2, - NO2, - NO3. Последние особенно легко утилизируются растениями для биосинтеза собственных азотистых соединений, в том числе растительных протеинов, которые в свою очередь служат пищей для животных, превращающих растительный белок в мочевину. Возникает глобальный цикл круговорота азота (рис.1).

Рисунок 1. Круговорот белкового азота. Взаимосвязь животных, растений и бактерий.

(Примечание: в двойных рамках – процесс в организме животных; в овальных – бактериальные процессы; жирные стрелки – биосинтетические реакции в растениях) ) 1- гидролиз белков животных; 2 - гидролиз аргинина и образование мочевины; 3 - гидролиз мочевины бактериями; 4 - окисление аммиака бактериями; 5- утилизация аммиака и диоксида углерода в растениях – синтез растительных белков; 6 – дезаминирование аминокислот.

В связи с важной экологической ролью фермента уреазы следует отметить характерные особенности этого фермента.

Весьма интересно, что высокая активность уреазы обнаружена в семенах ряда растений: соя, конский боб, арбуз. Несмотря на то, что уреаза была обнаружена очень давно Д. Самнером и еще в 1926 году очищена (именно из растительного источника) и получена в кристаллическом виде, ее функция у растений до сих пор остается непонятной [4, c. 78-109].

1.2 Функция уреазы в организме человека

Для здоровья и долголетия человека первостепенное значение имеют ферменты (белковые соединения) – катализаторы большинства биохимических процессов в организме.

Употребление в пищу некачественной пищи со всевозможными токсинами, а также продуктов, подвергшихся воздействию электромагнитных волн, способствуют образованию большого количества свободных радикалов, для обезвреживания которых организму приходится тратить запасы драгоценных ферментов.

В настоящее время прогрессируют такие заболевания, как гастрит, язва и рак пищеварительного тракта – так называемые «болезни образа жизни». А на самом деле, действительно ли только питание «на бегу» является причиной этих нарушений? При изучении литературы я внимательно ознакомилась с материалами VIII тематической сессии Российской группы по изучению Helicobacter pylori проходившей в 1999 г. в г. Уфе. В этих материалах имеется следующая информация: уреаза Helicobacter pylori (мочевинная амидогидролаза, ЕС 3.5.1.5) представляет собой важнейший энзим микроорганизма, определяющий основные звенья патогенеза острых и хронических гастритов типа В. В настоящее время установлено, что свыше 5 % всех клеточных белков Н.pylori приходится на долю уреазы, что свидетельствует о «чрезвычайном» уровне продукции данного энзима (1). Продукция уреазы является маркером многих микроорганизмов (в частности, Proteus mirabilis, Morganella morganii, Providencia rettgeri, Providencia stuartii, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Proteus vulgaris и др.), но H.pylori превосходит их по интенсивности экспрессии фермента в 2-10 раз (2, 3) [7]. Т.е. в желудке человека, из-за высокого содержания соляной кислоты, ни один микроорганизм не может существовать в принципе, бактерия Хеликобактер пилори (Helicobacter pylori) не только существует там, но и ведет свою «подрывную» деятельность. Helicobacter pylori, подобно большинству микроорганизмов, не обладает толерантностью в отношении низких величин рН, в то время как рН среды в желудке за счет присутствия больших количеств НСl, как правило, меньше. Для того, чтобы выжить и колонизировать слизистую оболочку желудка, микроорганизмы вынуждены преодолевать защитный барьер желудочного сока с помощью специального эволюционного механизма, ассоциированного с деятельностью микробной уреазы. Таким образом, в физиологических условиях постоянно поступающая путем транссудации из плазмы крови мочевина желудочного содержимого гидролитически расщепляется уреазой Н.pylori до NНз и угольной кислоты с последующим образованием гидроксида аммония и НСО3-аниона. Гидролиз мочевины завершается образованием щелочных продуктов, что приводит к алкалинизации и локальному повышению рН и соответственно - к защите микроорганизма при помощи перифокального «аммиачного облака», нейтрализующего НС1 желудочного содержимого.

Таким образом, можно сказать, что именно Хеликобактер виновна в появлении язв и гастритов, которые в ее присутствии могут привести к более страшным, необратимым последствиям. В 1994 г. Всемирная организация здравоохранения занесла Хеликобактер пилори в разряд канцерогенов первого класса.

2. Практическая часть

2.2 Опыт 1. Выявление уреазы в слюне учеников

Для определения её активности, мы взяли источником уреазы – слюну учащихся 10 класса и провели следующее исследование:

Цель работы: определить наличие мочевины в слюне человека.

Оборудование и реактивы: пробирки 10 шт., мочевина (1 %-й раствор), фенолфталеин (0,1-% спиртовой раствор).

Методика проведения опыта: в пробирки вносили 0,2-0,3 мл слюны учеников 10 В класса.

Одну из пробирок со слюной опустили в кипящую водяную баню на 5-10 с (для инактивации фермента) и охладили до комнатной температуры. Эта пробирка служит контрольной пробой. Во все остальные пробирки добавляли по 0,5-1,0 мл 1 %-ного раствора мочевины и затем сразу несколько капель фенолфталеина. В контрольной пробе окраска не изменилась во всех остальных пробирках произошло изменение окраски раствора. Время изменения окраски

Таблица 1.

Изменение окраски проб при добавлении мочевины в пробирки со слюной

Выводы: окрашивание проб в пробирках прошло неравномерно. Пробы в пробирках № 3,5,9 окрасились через 25 минут, в пробирках № 1,4 – через 28 минут, в пробирках № 2,6,10 – через 35 минут, в пробирках № 7,8 – через 40 минут (Рис. 2,3).

Химизм опыта достаточно прост: под действием уреазы слюны мочевина гидролизуется до аммиака, который подщелачивает среду, что и фиксируется с помощью кислотно-щелочного индикатора. Речь идет о ферменте, катализирующем гидролиз мочевины (карбамида) согласно реакции:

CO(NH2)2 + Н 2О → 2NH3 + СО2.

В опыте использован распространенный школьный индикатор, как фенолфталеин, но в этом случае потребовался более длительный период инкубации, чтобы образующийся аммиак подщелочил опытную пробу до рН 8,5-9,0.

Так как уреаза – это фермент, имеющий белковую природу, то кипячение одной пробирки с привело к инактивации фермента в этой пробе, на это указывает неизменность окраски после добавления фенолфталеина в данной пробе. (Рис.2,3.)

Рисунок 2. 10 пробирок со слюной разных учеников (11-я пробирка контрольная, после нагревания на водяной бане)

Рисунок 3. Окрашивание проб в пробирках после 40 минут эксперимента

2.2 Опыт 2. Определение влияния различных факторов на активность фермента уреазы

Цель работы: определить влияние различных факторов на активность фермента уреазы.

Оборудование и реактивы: пробирки 5 шт., мочевина (1 %-й раствор), фенолфталеин (0,1-% спиртовой раствор), суспензия, приготовленная из семян тыквы.

Методика проведения опыта: в 4 пробирки вносили 0,2-0,3 мл слюны одного человека:

- пробирка № 1 – слюну натощак (утреннюю, до чистки зубов);

- пробирка № 2 – слюну после чистки зубов;

- пробирка № 3 – слюну через 20-25 минут после приема пищи;

- пробирка № 4 – слюну после использования жевательной резинки в течение 5 минут;

В каждую пробирку добавили по по 0,5-1,0 мл 1 %-ного раствора мочевины и затем сразу несколько капель фенолфталеина.

Опыт 2.1. Отдельным опытом определяли наличие мочевины в жевательной резинке.

- пробирка № 1 – измельченная жевательная резинка (Stimorol), залитая горячей дистиллированной водой и охлажденной до комнатной температуры.

- пробирка № 2 - измельченная жевательная резинка (Dirol), залитая горячей дистиллированной водой и охлажденной до комнатной температуры.

Пробирка № 3 - измельченная жевательная резинка (Orbit), залитая горячей дистиллированной водой и охлажденной до комнатной температуры.

В каждую пробирку добавили по 2 мл суспензии и 1-2 капли фенолфталеина.

Результаты опыта помещены в таблицу 2.

Таблица 2.

Изменение окраски проб со слюной взятой у одного человека в течение дня

Выводы: Быстрее всего произошло окрашивание пробы в пробирке № 1 – через 15 мин., затем – в пробирке № 3 (через 25 минут), но окраска пробы была менее интенсивной, чем в пробирке № 1. В пробирке № 2 и 4 изменения не произошли. Объяснить такие результаты можно следующим образом: в пробе № 1 количество и активность микроорганизмов выше, чем в пробе № 3, тем более, могло произойти подавление действия фермента. Необходимо отметить, что некоторые вещества ингибируют действия фермента уреазы. Например, в чае, содержится вещество эпигаллокатехин-3-гаплат, которое ингибирует уреазу. В пробе № 2, после действия зубной пасты активность микроорганизмов уменьшилась, также, как и в пробе № 4, поэтому, вероятнее всего не произошло изменения окраски пробы.

В пробирках с жевательной резинкой окрашивание произошло только в пробирке № 2. Использование жевательных резинок после еды позволяет значительно снизить кислотность в ротовой полости. В слюне, зубном налете имеется большое количество микроорганизмов, влияющих на кислотно-основное состояние полости рта в норме и при патологии. Некоторые микроорганизмы образуют уреазу, вызывающую гидролиз мочевины с образованием аммиака. Аммиак связывает ионы Н+ с образованием иона аммония, что ведет к подщелачиванию ротовой полости. Одни производители жевательных резинок в качестве нейтрализующего средства используют гидрокарбонат натрия, другие – мочевину (карбамид). Поэтому в опыте были рассмотрены жевательные резинки разных производителей (Рис. 4, 5, 6).

Рисунок 4. Изменение окраски проб в пробирках № 1 и № 3 происходило постепенно, в пробах № 2 и № 4 не произошло изменений

Опыт с жевательной резинкой

Рисунок 5. По ½ подушечки каждой жвачки растворили в кипятке

Рисунок 6. В ходе реакции небольшие изменения произошли в окраске пробы № 2

2.3 Опыт 3. Определение фермента уреазы в различных растительных ферментах.

Цель работы: определить наличие фермента уреазы в семенах растений.

Оборудование и реактивы: форфоровая ступка и пестик, мерный цилиндр, пробирки 4 шт., вода дистилированная, мочевина (1%-й раствор), фенолфталеин (0,1-% спиртовой раствор), семена тыквы, семена огурца, семена кабачков, семена перца болгарского.

Методика проведения опыта:

1. Очистили семена от кожуры, растерли в ступке с 5 мл воды. Полученные суспензии перелили в пробирки:

- пробирка № 1 – семена перца болгарского;

- пробирка № 2 – семена огурца;

- пробирка № 3 – семена кабачков;

- пробирка № 4 – семена тыквы;

2. В пробирки добавили по 5 мл раствора мочевины.

3. В каждую пробирку добавили по 2-3 капли раствора фенолфталеина.

4. Содержимое пробирок перемешали и оставили при комнатной температуре, наблюдали изменение окраски проб в пробирках.

Полученные результаты помещены в таблицу 3.

Таблица 3.

Изменение окраски проб в пробирках с растительными ферментами

Выводы: в результате опыта выяснилось, что больше всего уреазы содержится в семенах тыквы, окраска пробы изменилась в первые 5 мин эксперимента, через 15 произошли небольшие изменения в пробе № 3 (хотя в литературе написано, что семена кабачков содержат уреазу. В данном случае, я считаю, что семена были недоспелые, поэтому фермент не активно проявил свою активность). В пробах № 1 и № 2 изменений не произошло (Рис. 7).

Рисунок 7. После добавления фенолфталеина сразу произошли изменения в пробирке № 4 (семена тыквы). Через 15 минут постепенно происходило окрашивание пробы № 3 (семена кабачка)

2.4 Опыт 4. Инактивация фермента уреазы.

Цель работы: экспериментально показать снижение каталитической активности уреазы в присутствии фенола и солей тяжелых металлов.

Оборудование и реактивы: пробирки 3 шт., мочевина (1 %-й раствор), фенолфталеин (0,1-% спиртовой раствор), суспензия, приготовленная из семян тыквы, растворы нитрата свинца (Pb(NO3)2) – 0,1 %; 0,05 %; 0,02 %; 0,01 %

Методика проведения опыта:

1. В каждую пробирки поместили приготовленную суспензию по 2 мл.
2. В каждую пробирку добавили по 2 мл раствора мочевины.
3. Затем в каждую пробирку добавили по 2-3 капли фенолфталеина.

Пробирки встряхнули.

4. Затем в каждую пробирку добавили растворы нитрата свинца разных концентраций:

Пробирка № 1 – раствор Pb(NO3)2) – 0,1%;

Пробирка № 2 – раствор Pb(NO3)2) – 0,05%;

Пробирка № 3 – раствор Pb(NO3)2) – 0,02%;

Пробирка № 4 – раствор Pb(NO3)2) – 0,01%;

Результаты эксперимента помещены в таблицу 5.

Таблица 5.

Изменение окраски проб в пробирках с разной концентрацией нитрата свинца

Выводы: данный эксперимент показал, что действие солей тяжелых металлов влияет на ферменты (ингибирует), насколько сильно происходит подавление фермента зависит от концентрации растворов солей. В нашем случае, при концентрации соли 0,1 %, окраска пробы исчезла полностью (проба № 1), при уменьшении концентрации раствора нитрата свинца, мы наблюдали небольшие изменения окраски проб (Рис. 8).

Рисунок 8. а) Первоначальный результат опыта (уреаза взаимодействует с мочевиной, это определяется при помощи фенолфталеина); б, в - после добавления растворов нитрата свинца разных концентраций, происходили изменения окраски проб

Проделав исследовательскую работу, мы выяснили, что ткани животных не содержат уреазу и, следовательно, не способны расщеплять мочевину; в противном случае это привело бы к образованию повышенных количеств аммиака и к аммиачному токсикозу в тканях. Однако это совершенно не означает, что в организме высших животных не осуществляется ферментативный гидролиз мочевины. Он происходит в тех органах организма, в которых активна деятельность микроорганизмов: желудочно-кишечный тракт, особенно толстый кишечник, ротовая полость, кожные покровы.

Но, нужно отметить и то, что появление уреазной активности в свежей моче свидетельствует об инфицировании мочеполового тракта.

Также, при изучении литературы по данной теме, мной было выяснено, что уреазопозитивные геликобактерии являются причиной язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, и в настоящее время разработаны на этой основе биохимические тесты для диагностики этих болезней.

Еще необходимо указать на важную роль уреазы в так называемом, рубцовом пищеварении у жвачных животных. У них возможна частичная замена ценного кормового протеина на дешевый карбамид (мочевину).

Заканчивая работу, я не имею возможность однозначно ответить на вопрос: уреаза - «эликсир жизни» или «нечистая сила»? С одной стороны, уреаза – ключевой фермент биодеградации мочевины, фермент, который помогает растениям усваивать из почвы азот, без которого не мог бы осуществляться биосинтез растительных протеинов, которые в свою очередь служат пищей для животных. Также важна роль уреазы в недопущении аммиачного токсикоза в тканях животных и человека. С другой стороны, уреаза представляет собой важнейший энзим микроорганизма, определяющий основные звенья патогенеза острых и хронических гастритов типа В. В настоящее время установлено, что свыше 5% всех клеточных белков Н.pylori приходится на долю уреазы. Роль уреазы Н.pylori на сегодняшний день только начинает изучаться и, несмотря на довольно значительное количество публикаций, она еще до конца не расшифрована. Дальнейшие углубленные исследования в этой области будут весьма желательны для окончательного прояснения механизмов возникновения хронического гастрита.

Список литературы:

1. Храмов В.А., Папичев Н.В., Штепа Л.И. Обнаружение фермента уреазы в слюне человека // Химия в школе. – 2003. – № 7. – С.57-59.
2. Строев Е.А. Биологическая химия: Учебник для фармац. мед. институтов. – М.: Высш. шк., 1986. – 479 с.
3. Дженкс В. Катализ в химии и энзимологии. М.: Наука, 1963. С. 45-73
4. Самнер Дж. Б. Химия ферментов и методы их исследований. М.: Химия, 1948.С. 78-109.
5. Кельнер Р., Мерме Ж.-М. Аналитическая химия. Проблемы и подходы. В 2-х томах. Том 2. М.: Мир, 2004. С.137
6. Гиззатова Г.Л., Шипаева Т. А. Уреаза – ключевой фермент биодеградации мочевины. Международный научно-исследовательский журнал ▪ № 3 (45), Часть 3, Март, 2016, с.88-90.
7. А.А. Нижевич, Р.Ш. Хасанов, Республиканская детская клиническая больница, г. Уфа. Материалы VIII тематической сессии Российской группы по изучению Helicobacter pylori, 18 мая 1999 г., Уфа