ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ МЕТАБОЛИЗМ В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ: АТИПИЗМ ФЕРМЕНТОВ ГЛИКОЛИЗА И ТРАНСПОРТЕРОВ ГЛЮКОЗЫ

Введение

Канцерогенез (лат. cancer – рак + греч. genesis – развитие, происхождение) – это сложный комплексный патофизиологический процесс возникновения и развития опухоли, характеризующийся изменениями на клеточном, субклеточном, молекулярно-генетическом уровнях и аномальным делением клеток. Во время развития раковой опухоли наблюдается бесконтрольная пролиферация клеток, нарушение их дифференцировки, а также морфологическая, функциональная и биохимическая атипичность. Модифицированные клетки перестают адекватно реагировать на все гуморальные сигналы, определяющие гомеостаз организма, и приобретают способность к автономному росту, внедрения в окружающие ткани и метастазированию гематогенным и лимфогенным путем. Таким образом, опухолевые клетки проявляют глубокие генетические, биохимические и гистологические различия по отношению к исходным, нетрансформированным клеткам.

Изменение метаболических процессов опухолевых клеток проявляется как следствие нарушения процессов пролиферации, регуляции и дифференцировки. В большинстве раковых клеток преимущественно наблюдается тенденция производить энергию за счет очень активного анаэробного гликолиза с образованием в качестве продукта молочной кислоты (лактата), причем анаэробный гликолиз остается предпочтительным метаболическим путем даже в условиях избыточного содержания кислорода. Уровень анаэробного гликолиза в интенсивно растущих раковых опухолях в десятки раз выше, чем в нормальных тканях. Например, гликолиз в клетках гепатомы у крыс в 2-17 раз выше, чем в нормальным гепатоцитах [7, с. 459–465]. Увеличение интенсивности анаэробного гликолиза, вероятно, является метаболической стратегией опухолевых клеток для обеспечения выживаемости и роста в среде с низкой концентрацией кислорода.

Изучение канцерогенеза и метаболических особенностей клеток различных опухолей является основой для понимания природы опухолей, а также для поиска новых методов диагностики и терапии онкологических заболеваний.

В данной статье рассмотрен атипизм ферментов гликолиза и транспортеров глюкозы в опухолевых клетках как фактор изменения энергетического метаболизма с целью «выживания».

Гликолитические ферменты в опухолевых клетках

Большое количество данных свидетельствует о том, что основным механизмом, при котором гликолиз существенно интенсивнее протекает в опухолевых клетках, является усиленная транскрипция генов ферментов данного метаболического пути и переносчиков глюкозы. Например, по сравнению с нормальными крысиными гепатоцитами все гликолитические ферменты экспрессируются значительно сильнее в крысиной AS-30D гепатоме: гексокиназа, гексозо-6-фосфатизомераза, фосфофруктокиназа, альдолаза (ALD), триозофосфат-изомераза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH), фосфоглицераткиназа, фосфоглицератмутаза, енолаза, пируваткиназа и лактатдегидрогеназа (LDH). Так, пируваткиназа активнее в 8-10 раз, а гексокиназа (HK) и фосфофруктокиназа типа 1 (PFK-1) в 17-300 раз [4, с. 1975–1988]. Для клеток HeLa раковой опухоли шейки матки человека все ферменты гликолиза, включая HK и PFK-1, выражены более чем в 2-7 раз [1, с. 217–224]. В гепатомах Морриса активность HK, PFK и пируваткиназы в 5-500 раз выше, чем в нормальных клетках печени; активность HK, ALD, пируваткиназы и LDH в 3,7-7 раз выше в клетках рака молочной железы, чем в клетках нормальной ткани [7, с. 459–465].

Возможно, основным движущим механизмом гиперактивного гликолиза является активация экспрессии генов гликолитических ферментов через фактор экспрессии HIF-1, который, в свою очередь, индуцируется гипоксией. HIF-1 является транскрипционным фактором, состоящим из двух субъединиц – HIF-1a и HIF-1b. Стабильность фактора в основном зависит от HIF-1a. При аэробном типе окисления глюкозы стимулируется активный процесс расщепления HIF-1a. HIF-1a может индуцироваться также цитокинами, факторами роста, реактивными кислородными метаболитами, оксидом азота, промежуточными продуктами обмена энергии пируватом, лактатом и оксалоацетатом. В свою очередь, усиление HIF-1 способствует экспрессии HK, PFK-1, PFK-2, ALD, GAPDH, фосфоглицераткиназы, енолазы, пируваткиназы и LDH, что приводит к стимуляции гликолиза. Линии метастатических опухолевых клеток, несмотря на содержание O₂, демонстрируют высокие уровни HIF-1a, чрезмерную экспрессию гликолитических ферментов и интенсивный анаэробный гликолиз, тогда как не метастатические опухолевые клетки увеличивают экспрессию HIF-1a и гликолитических ферментов только при гипоксии.

HIF-1a способствует анаэробному гликолизу также за счет увеличения экспрессии киназы пируватдегидрогеназного (PDH) комплекса, которая ингибирует путем фосфорилирования комплексную активность PDH, тем самым уменьшая окисление пирувата и цикл Кребса, но увеличивая образование лактата из пирувата (анаэробный гликолиз). Зависимость экспрессии других ферментов энергетического обмена от HIF-1a на данный момент еще не выяснена.

Онкоген c-Myc кодирует транскрипционный фактор c-Myc, который в трансформированных клетках, наряду с HIF-1a, может активировать гены ферментов гликолиза (гексозо-6-фосфатизомераза, PFK-1, GAPDH, фосфоглицераткиназа, енолаза и LDH) и переносчиков глюкозы 1 (GLUT1) в клетку, что также увеличивает интенсивность гликолиза [3, с. 345–354].

HK и PFK-1 входят в число ключевых ферментов гликолиза. В некоторых опухолевых клетках вследствие их генетической трансформации происходят изменения изоформ ключевых ферментов. Предполагается, что такие модификации также являются частью механизмов, участвующих в активации гликолиза в опухолевых клетках.

Гексокиназа

В клетках млекопитающих существуют четыре различных изоформы HK (HK-I, -II, -III и –IV, или глюкокиназа), которые отличаются кинетическими свойствами, а также тканеспецифической экспрессией и субклеточной локализацией. Преобладающей изоформой в головном мозге, молочной железе, почках и сетчатке является HK-I. HK-II преобладает в клетках скелетных мышц и жировых клетках, хотя ее активность относительно низкая. Поскольку HK-I и HK-II содержат специфический гидрофобный N-концевой сегмент, они могут быть либо связаны с наружной митохондриальной мембраной, либо находятся в свободном виде в цитозоле.

В быстрорастущих опухолевых клетках HK-II, по-видимому, является преобладающей изоформой, за исключением опухолей головного мозга, в которых преобладающей изоформой является HK-I. В гепатомах Новикова, H19 и AS-30D активность HK-II в 20-306 раз выше, чем активность HK в клетках печени [6, с. 913–919]. В клетках HeLa активность HK в 7 раз выше, чем в гепатоцитах [4, с. 1975–1988]. Существует некоторая несогласованность в сообщаемой активности HK в опухолях головного мозга человека. Описано, что активность HK в глиомах, медулобластомах и шванномах, полученных от терминальных пациентов, на 78% ниже, чем активность HK в нормальной ткани головного мозга.  Напротив, согласно другим данным, в эпендимоме крысы, в астроцитоме и глиоме человека, активность HK аналогична или более высокая, чем в контрольной ткани [2, с. 281–282].

Специфическим сайтом связывания HK-II с наружной митохондриальной мембраной является зависящий от напряжения анион-канал или порин. Такое взаимодействие защищает HK-II от протеаз и обеспечивает прямой доступ к вновь синтезированному АТФ с помощью АТФ-синтазы. Предполагается, что проапоптотический белок Bax образует вместе с порином канал для высвобождения цитохрома С в условиях стресса. Следовательно, повышенное связывание HK-II с порином, обнаруженное в быстрорастущих опухолевых клетках, может быть причиной нарушения функций Bax и блокирования апоптоза.

Накопление продуктов реакции, как известно, может уменьшить её скорость. Установлено, что глюкозо-6-фосфат (G6P) является мощным аллостерическим ингибитором HK-I, HK-II и HK-III. Следовательно, усиленная активность HK в опухолевых клетках должна быть уравновешена продуктом. В то же время, можно предположить, что связывание HK с митохондриями, более выраженное в опухолевых клетках, является механизмом, позволяющим обойти «блокаду» и прогрессировать. Однако при анализе в условиях близких к физиологическим (рН 7.0, температура 37°С и концентрация глюкозы и G6P >1мM) митохондриальная форма HK проявляла чувствительность к G6P, подобную чувствительности цитозольной формы HK в AS-30D опухолевых клеток [3, с. 345–354]. Наличие регуляторного механизма активности опухолевой HK с участием G6P играет важную роль в контроле за трофикой опухолей, несмотря на избыточную экспрессию фермента.

Фосфофруктокиназа 1-го типа

Существует три типа субъединиц PFK-1 в клетках млекопитающих – С, М и L. В печени и почках L-субъединица является наиболее распространенной, в скелетной мышце преобладает M-субъединица. Тромбоциты имеют только C-субъединицы, тогда как в головном мозге присутствуют C, L и M субъединицы. Каждая субъединица PFK-1 демонстрирует различные кинетические свойства. Например, C-субъединица имеет более низкую чувствительность к фосфоенолпирувату, одному из физиологических аллостерических ингибиторов PFK-1, что может способствовать увеличению гликолиза.

У разных злокачественных опухолей человека субъединицы C, L или обе преобладают над M-субъединицей. С другой стороны, экспрессия изоформ L и M увеличена в глиомах человека, тогда как в лейкозах T-cell и карциномах шейки матки преобладает C-субъединица.

В ряде злокачественных опухолей грызунов и человека активность PFK-1 в 1-5 раз выше, чем в нормальных клетках. Напротив, в некоторых опухолях человека (глиомы, менингиомы, шванномы, медулобластомы) и опухолях щитовидной железы крысы активность PFK-1 аналогична или даже в 1,3-2,5 раза ниже, чем в нормальных клетках.

Фосфофруктокиназа 2-го типа

В клетках млекопитающих имеется несколько изоформ PFK-2, которые кодируются четырьмя генами. Экспрессия этих генов зависит от ткани и ее развития. PFK-2 представляет собой бифункциональный фермент с активностью киназы и фосфатазы, которые регулируют клеточный уровень фруктозо-2,6-бифосфата, самого мощного активатора PFK-1 в нормальных и опухолевых клетках. Ген Pfkfb3 кодирует как конститутивную форму PFK-2 (изоформа с самым высоким отношением киназы / бисфосфатазы), так и индуцируемую форму PFK-2, которая образуется путем альтернативного сплайсинга. Переизбыток PFK-2, индуцируемый с помощью HIF-1a, приводит к увеличению фруктозо-2,6-бифосфата в некоторых опухолевых клетках. Этот механизм может, вероятно, способствовать усилению гликолиза в опухолевых клетках, поскольку активация фруктозо-2,6-бифосфатом PFK-1 может легко преодолевать ингибирование цитратом и АТФ.

Транспортеры глюкозы в опухолевых клетках

Доказано, что уровень мРНК и белка-транспортера глюкозы GLUT выше в опухолевых клетках, чем в нормальных здоровых тканях. Это увеличение может быть также частью механизмов, способствующих активации гликолиза в малигнизированных клетках. Существует несколько изоформ GLUT, экспрессируемых в клетках млекопитающих:

• GLUT1 - присутствует во всех тканях;
• GLUT2 - обилен в печени, поджелудочной железе, кишечнике и почках;
• GLUT3 - преобладает в мозге;
• GLUT4 - присутствует в скелетной мускулатуре, сердце, мозге и жировой ткани;
• GLUT5 - присутствует в тонком кишечнике, яичке, скелетной мышце, жировой ткани и почках;
• GLUT6 - присутствует в селезенке, лейкоцитах и головном мозге;
• GLUT7 –малоизвестная форма;
• GLUT8 - присутствует в яичках и головном мозге;
• GLUT9 - присутствует в печени и почках;
• GLUT10 - присутствует в печени и поджелудочной железе;
• GLUT11 - присутствует в сердечной и скелетной мышцах;
• GLUT12 - присутствует в сердце, тонком кишечнике и предстательной железе.

В нескольких видах опухолевых клеток преобладающей сверхэкспрессированной изоформой является GLUT1. Однако также могут быть чрезмерно выражены и другие изоформы, которые обычно не встречаются в нормальной ткани. Например, при некоторых лейкозах человека чрезмерно экспрессирована GLUT5 – изоформа, которая не обнаруживается в нормальных лейкоцитах [5, с. 9–26]. GLUT3 обнаруживается в клетках рака легкого, яичников и желудка.

В большинстве исследований, посвященных изучению экспрессии GLUT в опухолевых клетках, обнаружено повышенное содержание мРНК или белка, но, к сожалению, авторы данных работ не предпринимали попытки установить факт повышения функциональной активности транспортера. Встречаются единичные сообщения о некоторых кинетических параметрах GLUT в опухолевых клетках. В частности, показано, что активность GLUT опухоли в 10-12 раз выше, чем в нормальных клетках. В ряде экспериментов исследования активности проводились не с глюкозой, а с её аналогами, некоторые из которых не подвергаются дальнейшему метаболизму в клетках, что, как известно, влияет на работу белка-переносчика.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, метаболические изменения раковых клеток являются их отличительным признаком, играющим важнейшую роль в патогенезе злокачественных новообразований в течение всех стадий канцерогенеза и усиливающим выраженность всех признаков, которые присущи опухолевым клеткам. Результаты исследования особенностей метаболизма клеток злокачественных опухолей являются важными не только для более ранней и совершенной диагностики злокачественных новообразований, но и для создания новых методов химиотерапии, которые позволят действовать на раковые клетки с высокой избирательностью.

Список литературы:

1. Balinsky D., Platz C.E.& Lewis J.W. Enzyme activities in normal, dysplastic, and cancerous human breast tissues. / J Natl Cancer Inst – 1984 – P. 217–224.
2. Cornish-Bowden A& Cardenas M.L. Hexokinase and glucokinase in liver metabolism. / Trends BiochemSci - 1991 – P. 281–282.
3. Dang C.V., Lewis B.C., Dolde C., Dang G.& Shim H. Oncogenes in tumor metabolism, tumorigenesis, and apoptosis. / J BioenergBiomembr– 1997 – P. 345–354.
4. Marin-Hernandez A., Rodriguez-Enriquez S., Vital- Gonzalez P.A., Flores-Rodriguez F.L., Macias-Silva M., Sosa-Garrocho M.& Moreno-Sanchez R. Determining and understanding the control of glycolysis in fast-growth tumor cells. Flux control by an overexpressed but strongly product-inhibited hexokinase. – 2006 – P. 1975–1988.
5. Medina R.A.& Owen G.I. Glucose transporters: expression, regulation and cancer. / Biol Res – 2002 – P. 9–26.
6. Nakashima R.A., Paggi M.G., Scott L.J.& Pedersen P.L. Purification and characterization of bindable form of mitochodrial bound hexokinase from the highly glycolytic AS-30D rat hepatoma cell line. / Cancer Res – 1988 – P. 913–919.
7. Zu X.L.& Guppy M. Cancer metabolism: facts, fantasy, and fiction. / BiochemBiophys Res Commun– 2004 – P. 459–465.