ИССЛЕДОВАНИЕ КАЧЕСТВЕННОГО И КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОСТАВА КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ BACILLUS COAGULANS

На сегодняшний день получены клинические подтверждения относительно релевантности взаимосвязи между иммунной системой и пробиотическими микроорганизмами в защите хозяина от колонизации патогенными видами. Фактически, пробиотики производят множество веществ, начиная от относительно неспецифических жирных кислот и пероксидов до высокоспецифичных бактериоцинов, которые широко продемонстрировали ингибирование или уничтожение гнилостных бактерий.

Бактериальные биопленки формируются сообществами, которые встроены в самопроизвольно созданную матрицу внеклеточных полимерных веществ (EPS). Важно отметить, что бактерии в биопленках обладают набором «эмерджентных свойств», которые существенно отличаются от свободно живущих бактериальных клеток. Матрица биопленок несет характерные особенности - такие как социальное сотрудничество, обмен веществами и повышение выживаемости при воздействии антимикробных препаратов.

Большая часть исследований была направленна на отрицательные эффекты биопленок, связанных с патогенными бактериями. В данной работе проведены исследования влияния культуральной жидкости Bacillus coagulans на жизнедеятельность культуры Bifidobacterium bifidum.

Целью научно-исследовательской работы является изучение химического состава культуральной жидкости Bacillus coagulans.

Поставлены следующие задачи:

1. Подобрать методы исследования культуральной жидкости Bacillus coagulans.
2. Исследовать химический состав культуральной жидкости Bacillus coagulans.

Экспериментальная часть

1. Исследование качественного и количественного состава культуральной жидкости Bacillus coagulans

Для получения посевного материала и культуральной жидкости используют питательную среду следующего состава: пептон - 2,5 г, глюкоза - 5 г, вода - до 250 мл. Культуру Bacillus coagulans выращивают в течение 24 часов, а затем пропускают через микробиологический фильтр, получая культуральную жидкость.

Полученную культуральную жидкость исследуют на качественный состав: определение белков, углеводов, липидов.

Для определения наличия белков, была проведена биуретовая реакция.

Берется 2 мл культуральной жидкости и 2 мл раствора гидроксида натрия, после этого смесь нагревается с добавлением нескольких капель раствора медного купороса CuSO₄  [1]. С целью более точного определения, данный опыт проводится в трех повторах. В результате наблюдается фиолетовая окраска, что свидетельствует о наличие белков.

Дополнительно, с целью определения наличия белков, была проведена нингидриновая реакция. В пробирку вносят 5 капель раствора культуральной жидкости и 2 капли раствора нингидрина. Содержимое пробирки перемешивается на водяной бане при температуре 70⁰С в течение 5 мин. Для более точного определения, данный опыт проводят в трех повторах. В результате наблюдается сине-фиолетовая окраска, что свидетельствует о наличие белков. Сущность реакции заключается в том, что α- аминокислоты и пептиды, реагируя с нингидрином, подвергаются окислительному дезаминированию и декарбокселированию [2].

Наличие радикала аминокислоты в составе этого соединения обусловливает различную окраску (красную, жёлтую, голубую) соединений, возникающих при реакции аминокислот с нингидрином.

Реакция с нингидрином является специфической для аминокислот, содержащих α-аминогруппу, и характерна как для некоторых карбоновых, так и циклических аминокислот. В реакции глицина с нингидрином образуется комплексное соединение, имеющее сине-фиолетовую окраску.

Для определения наличия углеводов, была проведена реакция Троммера. В пробирку с культуральной жидкостью добавляется 6 капель 2Н NaOH. Затем по каплям добавляют 0,2H раствор CuSO₄, затем пробирку постепенно нагревают на водяной бане до изменения окраски. Опыт был поставлен в трех повторах. В результате эксперимента наблюдается изменение цвета до светло – коричневого, осадок не образовался, что свидетельствует об отсутствии углеводов.

Для более точного определения содержания углеводов, к исследуемой культуральной жидкости добавили 2 капли спиртового раствора α–нафтола. По стенке пробирки к смеси осторожно приливают 1 мл концентрированной серной кислоты так, чтобы кислота не смешивалась с культуральной жидкостью.

Данный опыт показал отсутствие темно–фиолетового кольца на границе двух слоев, со слабым изменением цвета, что свидетельствует об отсутствие углеводов.

Известно, что α–нафтол можно заменить другими веществами, способными- конденсироваться производными фурфурола с образованием окрашенных продуктов. Так в этих условиях тимол дает красное окрашивание [3].

Реакция с заменой α–нафтола на тимол, показывала отсутствие красного окрашивания, что говорит о том, что углеводы отсутствуют.

Для определения содержания липидов была проведена тонкослойная хроматография основанная на различии в скорости перемещения компонентов смеси в плоском тонком слое. Продвижение подвижной фазы вдоль листа не наблюдалось, показывая отсутствие липидов.

Точный количественный анализ белка имеет важное значение для всех экспериментов, поэтому был проведен метод Лоури.

Во все пробирки добавляем по 2 мл реактива №3, смесь тщательно перемешивают. Через 10 мин добавляют 0,2 мл реактива №4 Фолина—Чокальтеу. Реакционную смесь перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Интенсивность развившейся окраски измеряют на фотоколориметре при длине волны 750 нм [4]. Экспериментально показано  содержание белка составляет 0,95 мг/мл.

  1.1 Оценка степени влияния различных объемов культуральной жидкости Bacillus coagulans на жизнедеятельность Bifidobacterium bifidum

В эксперименте исследовали влияние различных объемов фильтрата культуральной жидкости B. сoagulans на стимуляцию роста кисломолочных бактерий B. bifidum. Для изучения использовали суточную культуру B. сoagulans: условия культивирования t=50⁰C, τ=24 ч, рН=5,5, глюкозопептонная среда следующего состава: 5,05 г пептона добавляют 2,5 г глюкозы и доводят дистиллированной водой до объема 250 мл. При необходимости довести pH среды до 5,5 разбавленной соляной кислотой. Для исследования влияния компонентов культуральной жидкости и клеток B. сoagulans проводили разделение культуральной жидкости (к/ж) и биомассы (б/м) с использованием мембранного фильтра (n=0,5мкм) и водоструйного насоса. В качестве параметров оценки влияния объема культуральной жидкости B. сoagulans на жизнедеятельность B. bifidum были выбраны: время сбраживания, форма сгустка и морфология клеток.

Результаты эксперимента представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Исследование влияния объема культуральной жидкости B. сoagulans на рост B. bifidum.

Выводы

1. Исследовали качественный и количественный состав культуральной жидкости Bacillus coagulans. Для определения качественного состава белка использовали биуретовую и нингидриновую реакции, которые показали наличие белков в культуральной жидкости. Количественный состав был определен методом Лоури, показав, что содержание белка в культуральной жидкости 0,95 мг/мл. Для исследования культуральной жидкости на наличие углеводов, использовали реакцию Троммера, которая показала, что углеводы отсутствуют. Реакция Троммера с заменой α–нафтола на тимол показала, что углеводы отсутствуют. В результате проведения тонкослойной хроматографии липиды не были обнаружены.
2. Исследовали влияние B. coagulans на рост B. Bifidum, определив степень влияния различных объемов культуральной жидкости Bacillus coagulans. Из эксперимента видно, что при различных дозах внесения культуральной жидкости B. сoagulans наблюдается положительная микробиологическая картина: грамположительные палочки; клетки прямые или в виде запятой, с булавовидным утолщением на конце, иногда ветвящиеся (У, Т-формы), зернистые, образуют цепочки. Однако при дозах внесения 0,7-1,5 мл количество клеток в поле зрения незначительное, клетки крупные по сравнению с дозами внесения 0,3-0,5 мл.
3. Культура B. coagulans при объеме внесения культуральной жидкости 0,5 мл увеличивает содержание B. bifidum до 30*10²⁴ КОЕ/мл, что косвенно говорит о продуцировании B. coagulans внеклеточных стимулирующих веществ, которые положительно влияют на рост B. bifidum.

Список литературы:

1. Каррер П., Курс органической химии, пер. с нем., 2 изд.. Л.. 1962; Karrer P., "Course in organic chemistry"1956, v. 56, № 1. P. 181-87. П.Д. Решетов. [электронный ресурс] — Режим доступа. — URL:http://www.xumuk.ru/encyklopedia/584.html (дата обращения 13.12.16).
2. Ленинджер А., Основы биохимии, пер. с англ., т. 1, М., 1985; Lehninger A., "Principles of Biochemistry", p. 126-27. П. Д. Решетов.
3. Шапиро Д. К., Практикум по биологической химии: учеб. пособие. М.: 2-е изд., 1976. — с 117.
4. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. №1. P. 265-275.