СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ САЛЬМОНЕЛЛ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

Кишечные инфекции являются одними из распространенных заболеваний по критерию смертности среди населения планеты. По международным оценкам во всем мире ежегодно выявляют более 3 млн. случаев заражения со смертельным исходом, связанных с грамотрицательными кишечными патогенами из-за диареи и кишечной лихорадки.

Производство мясной продукции в РФ за 17 лет выросло в 6 раз. По данным МСХ РФ в 2017 г производство скота и птицы на убой (в живом весе) в хозяйствах всех категорий составило 14,6 млн. т, т.е. по сравнению с 2016 г увеличилось на 4,7 %, что благоприятно сказалось на работе перерабатывающих предприятий [3].

В счет увеличения потребления и производства мяса птицы повышается потенциальный риск загрязнения продовольственных товаров сальмонеллами. По статистическим данным Роспотребнадзора, за январь-апрель 2016 г в РФ было зарегистрировано 10347 случаев сальмонеллезных инфекций, 2246 случаев в шигеллеза, 180534 случая острых кишечных инфекций, вызванных неопределенными инфекционными возбудителями.

Сальмонеллёз – это пищевая токсикоинфекция, которая ассоциируется с потребление контаминированных пищевых продуктов, свежего или обработанного мяса и птицы, а также яиц. По итогам 2017 г душевое потребление мяса птицы в РФ составило 34,3 кг. Для сравнения, в 2012 г ― 29,0 кг, в 2007 г ― 22,5 кг, 2002 г ― 16,1 кг, т.е. потребление мяса за 15 лет увеличилось более чем в 2 раза. Чтобы недопустить контаминацию и распространение возбудителя необходимо проводить контроль качества выпускаемой продукции [5, с. 13 - 14].

Род Salmonella входит в семейство Enterobacteriaceae и включает в себя вид S. enteritica и серовары: S. typhimurium, S. choleraesuis и S. enteritidis. Современная серологическая классификация сальмонелл насчитывает свыше 2500 сероваров и бактерий видов S. enterica и S. bongori. Вид S. bongori включает в себя только 22 серовара,. а вид S. enterica 2557 сероваров, которые подразделяются на 6 основных подвидов: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae, indica. В состав клеток сальмонелл входят O-, H-, Vi-, M- и K- антигены, на основе общности соматических антигенов обозначают – 1, 2, 3…15. Дифференциацию внутри группы осуществляют по H-антигенам (a, b, c, d) [6, с. 60 - 63].

За последние 25 лет были приняты попытки разработать усовершенствованные методы обнаружения и идентификации сальмонелл в продуктах животного происхождения. В данной работе рассмотрим методы, используемые для идентификации сальмонелл.

На сегодняшний день выявление в пищевых продуктах сальмонелл проводят с использованием ПЦР-диагностики. ПЦР используется в качестве основного метода идентификации для ускоренного обнаружения сальмонелл в сфере молекулярной биологии. Мишенью для амплификации ДНК бактерий служат части нуклеиновых кислот патогена. Важной особенностью метода ПЦР-Real time является возможность распознавания и идентификации продуктов амплификации ДНК бактерии при непосредственном проведении реакции. Процедура ПЦР анализа продуктов питания по выявлению сальмонелл регламентируется  ГОСТ Р ИСО/МЭК-17025.

На первом этапе постановки реакции ПЦР необходимо увеличить численность сальмонелл, с этой целью проводят обогащение образцов. Однако в ходе обогащения клетки сальмонелл могут вытесняться другими микроорганизмами или ингибироваться специализированными метаболитами, например антибиотиками. Кроме того необходимо исключить и ложноположительные результаты при распознавании ДНК нежизнеспособных клеток. Для этого существуют специальные методы отделения популяции сальмонелл от фона других микроорганизмов. Например, иммуномагнитная сепарация клеток (ИСК) которая основывается на взаимодействии очищенных антител, ковалентно связанных на поверхности парамагнитных частиц, с колониями сальмонелл. Однако чувствительность данного метода ограничена связывающей специфичностью антител к клеткам бактерий, что имеет решающее значение для предотвращения ложноотрицательных результатов. Очевидными преимуществами ПЦР диагностики являются быстрота выполнения анализа, чувствительность и специфичность обнаружения, но высокая стоимость оборудования и другие затраты останавливают производителей в пользу более простых и классических методов [2].

Кроме ПЦР существует ИФА-тест, разработанный для идентификации бактерий рода Salmonella. Этот тест содержит ряд специальных компонентов, позволяющих быстро подтвердить наличие или отсутствие в пищевых продуктах патогенных микроорганизмов. Патогены обнаруживаются через уникальную комбинацию ELISA метода иммунохроматографии и появления окрашенного сигнала. Используются тесты Singlepath или Duopath, в состав которых входят коллоидные, меченные золотом антитела к патогенным антигенам. Комплекс антиген-антитело перемещается на мембрану к реакционной зоне, где образуется красная полоса. Тест содержит зону контроля, и если его работа верна, образуется вторая красная линия. Преимуществами данного метода является значительное сокращение времени исследований (на 48 ч), высокая специфичность и надежность определения. Метод не предусматривает сложных процедур пробоподготовки и использования каких-либо дополнительных приборов или устройств [4].

К ускоренным методам выявления бактерий рода Salmonella относится использование специализированной среды Salmosyst, где изначально микроорганизмы проходят стадию неселективного обогащения. Обогащение проводят на среде Salmosyst® Broth Base, с добавлением таблетки Salmosyst® Selective Supplement, которая увеличивает рост сальмонелл и подавляет сопутствующую микрофлору. Для идентификации сальмонелл культуру высевают на одну из дифференциально-диагностических сред. Преимуществом данного метода является сокращение времени исследования на 24-48 ч, а также высокая чувствительность (выявляются поврежденные клетки сальмонелл), простота выполнения анализа и экономичность. Этот метод одобрен Центром Гигиены и Эпидемиологии Роспотребнадзора (МР №24ФЦ/976) и разрешен к применению в лабораториях санитарно-эпидемиологической службы, осуществляющих государственный и ведомственный контроль, а также в производственных лабораториях.

Кроме вышеперечисленных методик существует еще метод выявления бактерий рода Salmonella с использованием специализированной полужидкой среды Раппопорта-Вассилиадиса (среда MSRV) с новобиоцином. На этой среде сальмонеллы образуют светлую непрозрачную зону роста. Рост сопутствующих бактерий ингибируется введением новобиоцина, наличием хлорида магния, малахитового зеленого и культивированием при повышенной температуре – 41,5 °С. Преимуществом метода является время исследования, которое составляет 24-48 ч (за счет совмещения этапа селективного обогащения с этапом высева на агаризованную среду) и высокая чувствительность, обеспечивающая выявление даже единичных клеток сальмонелл, а также экономичность метода [1].

На российском рынке широко представлена экспресс-система для определения сальмонелл Petrifilm^® SALX. Данный тест предназначен для быстрого выявления и биохимического подтверждения сальмонелл в обогащенных образцах пищевых продуктов и производственных объектов. Учет результатов проводят через 44-52 ч. Дополнительный анализ на наличие сальмонелл и других патогенных микроорганизмов проводят по системе молекулярного анализа 3М^™. В основе разработанной системы лежит комплекс изотермической амплификации ДНК и биолюминесцентной детекции. Использование данного сочетания обеспечивает высокую чувствительность и точность результатов, которые учитывают через 24-27 ч  [4].

Матрично-лазерная десорбционная ионизация масс-спектрометрии (МАЛДИ-МС) – это распространенный метод, используемый для бактериологического исследования. Данный метод позволяет выявить уникальный набор белков исследуемых микроорганизмов, т.е. своеобразный «отпечаток пальца». Анализ белков позволяет надёжно и точно проводить идентификацию до вида микроорганизма путём сопоставления получаемых масс-спектров белков со специализированной базой данных. Существует MALDI Biotyper – программно-аппаратный комплекс, предназначенный для быстрой идентификации микроорганизмов с использованием MALDI-ToF масс-спектрометров серии FLEX. MALDI-ToF MS является эффективным инструментом для идентификации рода и некоторых видов. Однако для этого необходимо выделить чистую культуру микроорганизма для анализа сложных матриц, например, продукты питания, смеси бактерий.

Метод идентификации сальмонелл с помощью масс-спектрометрии обеспечивает прямое обнаружение присутствия выраженных бактериальных рибосомальных белков, где каждый воспроизводимый результат видоспецифичен. Преимуществом масс-спектрометрии является отсутствие необходимости в пробирном отборе материала. Масс-спектральные отпечатки содержат достаточно наблюдаемых белков, что делает его достаточно мультиплексным анализом [2].

Альтернативой MALDI-ToF MS является обнаружение бактериальных белков с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии ― метод разделения и анализа сложных смесей веществ, в котором подвижной фазой является жидкость. Данный метод показал большие перспективы для дифференциации близкородственных видов с пределах семейства Enterobacteriaceae и выявления белков-биомаркеров для разработки зондов ПЦР [2].

Заключение

Таким образом, методов применяемых для индикации и идентификации бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах достаточно много. Однако не все методы будут рекомендоваться или даже использоваться для определенного случая диагностики при исследовании сырья и продуктов животного и растительного происхождения. Производительность самого метода будет зависеть от общей чувствительности, его специфики, а также технической сложности. Влияют также и внешние факторы, включая набор навыков специалиста и техническое мастерство, стоимость оборудования и материалов. Но в итоге, при систематической проверке методов установится их полезность и эффективность.

Главной целью новых разработок является сокращение времени и автоматизация  лабораторной диагностики. Важно отметить, что результаты применения одного метода будут способствовать улучшению характеристик другого, даже если они непосредственно не будут связаны между собой.

Список литературы:

1. ГОСТ Р 53665-2009. Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Метод выявления сальмонелл.
2. МУ 4.2.2723-10 Лабораторная диагностика сальмонеллезов, обнаружение сальмонелл в пищевых продуктах и объектах окружающей среды.
3. Абдуллаева А.М., Серегин И.Г., Удавлиев Д.И., Соколова Н.А., Лощинин М.Н., Мамедбердыева М.Д. Микробиологическая безопасность полуфабрикатов из мяса птицы /// Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. – 2017. – № 2 (22). – С.11-15.
4. Абдуллаева А.М., Смирнова И.Р., Трохимец Е.В.,  Губанкова А.А. Микробиологический контроль полуфабрикатов из мяса индеек при холодильном хранении //  Ветеринария. – 2017. – № 8. – С. 49-53.  
5. Серегин И.Г., Дюльгер Г.П., Кульмакова Н.И., Абдуллаева А.М. Ветеринарно-санитарная экспертиза при переработке птицы. Учебное пособие. – Санкт-Петербург:  Квадро. – 2017. –  200 с.
6. Соколова Н.А., Абдуллаева А.М., Лощинин М.Н. Возбудители зооантропонозов, пищевых отравлений, порчи сырья и продуктов животного происхождения. Учебное пособие. – М.: ДеЛи плюс, – 2015. – 170 с.