ИСПОЛЬЗОВАНИЕ  МОЛЕКУЛЯРНОГО  ИССЛЕДОВАНИЯ  ДЛЯ  ВЫЯВЛЕНИЯ  ПРИМЕСЕЙ  ВО  ФРУКТОВЫХ  СОКАХ  И  МУЛЬТИСОКАХ

Самойлов  Артем  Владимирович

канд.  биол.  наук,  зав.  научно-исследовательской  испытательной  лабораторией  по  определению  ГМИ  в  сырье  и  пищевой  продукции  ГНУ  Всероссийский  научно-исследовательский  институт  консервной  и  овощесушильной  промышленности,  г.  Видное,  Московской  обл.

E-mail:  gmivniikop@rambler.ru

Колпаков  Евгений  Юрьевич

аспирант,  научный  сотрудник  научно-исследовательской  испытательной  лабораторией  по  определению  ГМИ  в  сырье  и  пищевой  продукции  ГНУ  Всероссийский  научно-исследовательский  институт  консервной  и  овощесушильной  промышленности,  г.  Видное,  Московской  обл.

E-mail: 

THE  USE  OF  MOLECULAR  STUDIES  TO  IDENTIFY  IMPURITIES  IN  FRUIT  JUICES  AND  MIXED  JUICES

Artem  Samoylov

candidate  of  Biology  Sciences,  Head  of  Research  Testing  Laboratory  by  definition  of  GMO  in  food  and  feed  products,  Russian  Research  Institute

of  Canning  and  Vegetable-Drying  Technology,  Vidnoye,  Moscow's  region.

Evgeniy  Kolpakov

graduate  student,  Research  Collaborator  of  Research  Testing  Laboratory  by  definition  of  GMO  in  food  and  feed  products,  Russian  Research  Institute

of  Canning  and  Vegetable-Drying  Technology,  Vidnoye,  Moscow's  region.

АННОТАЦИЯ

Рассмотрена  возможность  применения  молекулярных  маркеров  рода  Prunus  для  выявления  состава  фруктовых  соков  из  плодов  абрикоса,  персика,  нектарина,  вишни,  черешни.  Праймеры  PruC2m,  UDAp-404  и  UDP96-003  специфичны  к  черешне,  персику  и  вишне  соответственно. 

ABSTRACT

Considered  the  possibility  of  using  molecular  markers  to  identify  the  genus  Prunus  tampering  with  fruit  juice  from  the  fruit  of  apricot,  peach,  nectarine,  cherry,  sweet  cherry.  Primers  PruC2m,  UDAp-404  and  UDP96-003  are  specific  to  the  sweet  cherry,  peach  and  cherry,  respectively.

Ключевые  слова:  фруктовые  соки,  примеси,  ДНК,  ПЦР,  олигонуклеотидные  праймеры

Keywords:  fruit  juices,  impurities,  DNA,  PCR,  oligonucleotide  primers

Род  Prunus  (Слива)  включает  большое  количество  видов  плодовых  растений,  плоды  которых  используются  в  пищу,  в  том  числе  в  виде  соков.  По  ITIS  (Integrated  Taxonomic  Information  System)  род  Prunus  подразделяется  на  подрод  Amygdalus  (Миндаль),  включающий  вид  Prunus  duclis  (Миндаль)  и  вид  Prunus  persica  (Персик)  подрод  Prunus  (Слива),  включающий  вид  Prunus  domestica  (Слива  домашняя)  и  вид  Prunus  armeniaca  (Абрикос),  подрод  Cerasus  (Вишня),  включающий  вид  Prunus  cerasus  (Вишня)  и  вид  Prunus  avium  (Черешня).  Следует  отметить  существование  такой  вариации  персика  как  нектарин,  или  персик  неопушённый  (Prunus  persica  var.  Nucipersica),  являющийся  результатом  почковой  мутации;  при  этом,  на  одном  дереве  могут  произрастать  одновременно  и  плоды  персика,  и  плоды  нектарина  [9].

В  структуре  потребления  соков  в  России,  персиковый  и  вишнёвый  соки,  а  также  сокосодержащие  на  их  основе  напитки,  занимают  4,1  %  и  2,1  %  соответственно  [2]. 

На  сегодняшний  день  состав  соков  и  соковой  продукции  регламентируются  Федеральным  законом  №  178-ФЗ  [4],  а  также  Государственным  стандартом  (ГОСТ),  в  частности,  он,  устанавливает  пороги  недопустимых  модификаций  состава  соков  и  соковой  продукции,  где  указывает  на  запрет  добавления  вишнёвого  и  других  соков  «красных»  фруктов  в  гранатовый  сок  [1]. 

Одной  из  часто  встречающихся  форм  фальсификации  соков  является  купажирование  дорогих  соков  (смешивание)  с  дешёвыми  соками  без  декларирования  этого  факта.  Например:  сок  абрикоса  добавляют  в  сок  персика,  яблочный  сок  смешивают  с  виноградным,  мандариновый  сок  с  апельсиновым.  В  смеси  соков  сложно  выявить  их  ингредиентный  состав,  также  сложно  определить  добавление  соков,  схожих  по  вкусовым  качествам  с  исходным  соком;  в  связи  с  этим,  фальсификация  либо  не  определяется,  либо  приходится  прибегать  к  дорогостоящим  методам  высокоэффективной  жидкостной  хроматографии,  спектрометрии,  либо  к  сложным  аналитическим  методам  химического  анализа.  Причём  ни  один  из  этих  методов  не  гарантирует  обнаружения  незначительного  присутствия  других  соков  [3].

В  последнее  время,  молекулярные  технологии  успешно  помогают  описывать  генетическое  разнообразие.  Указывать  на  сходства  и  различия,  а  также  родственность,  помогают  различные  типы  молекулярных  маркеров,  таких  как:  RAPD  (случайно  амплифицированная  полиморфная  ДНК),  RFPL  (фрагменты  ограниченного  полиморфизма),  AFPL  (фрагменты  с  усиленным  полиморфизмом)  и  SSR  (простые  повторяющиеся  последовательности)  [5]

Метод  ПЦР  позволяет  обнаружить  присутствие  посторонней  ДНК  в  составе  исследуемой  продукции.  Данный  метод  высокочувствителен  и  способен  выявлять  ДНК  искомого  продукта,  даже  при  его  концентрации  до  5  %,  а  вероятность  его  обнаружения  составляет  99,9  %.

На  сегодняшний  день  разработаны  ДНК-системы  анализа  пищевых  продуктов  и  сырья  для  обнаружения  генетически  модифицированных  ингредиентов  (ГМИ),  выявления  пищевых  патогенных  микроорганизмов,  аллергенов,  а  также  идентификации  видовой  принадлежности  мясных  и  растительных  ингредиентов  [3].

На  основании  имеющихся  молекулярно-генетических  приёмов  представляется  возможным  разработать  метод,  предназначенный  для  выявления  возможной  фальсификации,  связанной  с  замещением  сырьевого  состава  соками  плодов  растений  рода  Prunus.

Объекты  и  методы  исследования

Материалом  для  исследования  являлись  соки,  полученные  из  плодов  абрикоса,  персика,  нектарина,  вишни  и  черешни.  Соки  отбирали  в  пробирки  объёмом  15  мл.  Для  выделения  ДНК  из  каждой  пробы  отбирали  по  200  мкл  сока  и  переносили  в  микроцентрифужные  пробирки  типа  Эппендорф  объёмом  1,5  мл.

Выделение  ДНК  проводили  по  протоколу  комплекта  реагентов  для  выделения  ДНК  «ПРОБА-ЦТАБ»  (ООО  «ДНК-Технология»,  Россия,  Москва).  Концентрацию  экстрагированной  ДНК  оценивали  с  помощью  спектрофотометра  Varian  Cray  100  Scan.

Для  оптимизации  параметров  амплификации  были  отобраны  6  пар  праймеров,  среди  которых  праймеры  черешни,  вишни,  абрикоса,  персика.  Синтез  праймеров  осуществлялся  фирмой  ООО  «СибЭнзим-М»  (Россия,  Новосибирск).  Нуклеотидные  последовательности  праймеров  приведены  в  таблице  1. 

Таблица  1.

Нуклеотидные  последовательности  праймеров

Расчёт  температуры  отжига  проводили  по  формуле  Уоллеса: 

Tm=  2  (А  +  Т)  +  4  (G+  C)

где:  значения:  A,  T,  G,  C  соответствуют  количеству  нуклеотидов  аденина,  тимина,  гуанина  и  цитозина  [10].

Постановку  ПЦР  проводили  с  использованием  набора  реагентов  GenPak  PCR  Core  (ООО  «Лаборатория  ИзоГен»,  Россия,  Москва)  на  программируемом  амплификаторе  «ТерцикТМ»  (ООО  «ДНК-Технология»,  Россия,  Москва).  В  состав  реакционной  смеси  объёмом  20  мкл  входили:  дюлиент  —  10  мкл,  готовый  раствор  праймеров  —  5  мкл,  образец  ДНК  —  5  мкл,  Taq  ДНК  полимераза,  дезоксинуклеозидфосфаты  —  200  мкМ  и  хлорид  магния  —  2,5  мM. 

Продукты  ПЦР  разделяли  электрофоретически  в  2  %  агарозном  геле  (ООО  «Компания  Хеликон»  Россия,  Москва)  в  ТВЕ-буфере  (121,1  г  Трис-HCl,  51,35  г  борной  кислоты,  3,72  г  ЭДТА  в  1  л  бидистилированной  воды)  с  добавлением  бромистого  этидия  (ООО  «Компания  Хеликон»,  Москва)  (20  мг/мл)  до  конечной  концентрации  0,5  мкг/мл.  Продукты  ПЦР  визуализировали  в  ультрафиолетовом  свете  с  длиной  волны  366  нм  и  фотографировали.

Результаты  исследований

Наиболее  важным  параметром  амплификации  является  температура  отжига  праймеров.  Оптимальной  является  та  температура,  при  которой  реакция  проходит  без  образования  неспецифических  продуктов.  Нормальный  диапазон  температуры  отжига  праймеров  —  36—75  °C.  Первоначально,  при  постановке  реакции,  использовали  данные  из  литературных  источников.  Однако  не  во  всех  случаях  реакция  проходила  успешно.  Для  получения  оптимального  и  достоверного  результата  мы  постепенно  повышали  значение  температуры  отжига  праймеров.  Так,  для  пары  праймеров  UDP96-001  полученную  из  литературных  источников  температуру  57  °C,  мы  повышали  до  67  °C.  Перечень  температурных  режимов  приведён  в  табл.  2.

Таблица  2.

Перечень  параметров  температуры  отжига

Для  проведения  ПЦР  были  выбраны  следующие  универсальные  временные  отрезки:  4  мин  —  первичная  денатурация,  амплификация:  15  с  —  денатурация,  60  с  —  отжиг  праймеров,  30  с  —  полимеризация.

Подобранные  условия  позволили  хорошо  визуализировать  результаты  полимеразной  цепной  реакции  и  зафиксировать  их  (Рис.  1).

Рисунок  1  Результаты  ПЦР  анализа  с  использованием  пар  праймеров:  а  —  PruC2m,  б  —  UDAp-404,  в  —  UDP98-022,  г  —  UDP98-024,  д  —  UDP96-001,  е  —  UDP96-003.  1  —  отрицательный  контроль,  2  —  сок  абрикоса,  3  —  сок  персика,  4  —  сок  нектарина,  5  —  сок  вишни,  6  —  сок  черешни

Как  видно  из  представленных  снимков  во  всех  случаях  качественная  реакция  прошла  успешно  с  образованием  визуализируемых  полос  ампликонов.  Стоит  отметить,  что  праймеры  PruC2m,  UDAp-404  и  UDP96-003  оказались  видоспецифичны  только  к  одному  из  образцов,  а  праймеры  UDP98-022,  UDP98-024  и  UDP96-001  проявляют  полиморфизм  по  отношению  к  нескольким  пробам.  Результаты  качественной  реакции  для  идентификации  фруктовых  соков  приведены  в  табл.  3.

Таблица  3. 

Результаты  качественного  анализа  соков  разными  наборами  праймеров

Для  определения  возможности  выявления  факта  смешивания  разных  образцов  соков  была  поставлена  задача  выявить  внесение  постороннего  сока  в  образец  в  пропорции  1:20.  Пробы  формировали  следующим  образом:  проба  1  —  9,5  мл  персикового  сока  +  0,5  мл  сока  абрикоса,  проба  2  —  9,5  мл  гранатового  сока  +  0,5  мл  сока  вишни,  проба  3  —  9,5  мл  гранатового  сока  +  0,5  мл  сока  черешни.  Результат  выявления  данного  факта  методом  ПЦР  представлен  на  рис.  2.

Рисунок  2.  Результаты  ПЦР  анализа  с  использованием  пары  праймеров:    а  —  UDAp-404,  б  —  PruC2m,  в  –  UDP96-003;  а  —  1  —  Сок  персика  100  %  (отрицательный  контроль).  2  —  Сок  персика  95  %  +  сок  абрикоса  5  %,  б  —  1  —  Сок  граната  100  %  (отрицательный  контроль),  2  —  Сок  граната  95  %  +  сок  черешни  5  %,  в  —  1  —  Сок  граната  100  %  (отрицательный  контроль),  2  —  Сок  граната  95  %  +  сок  вишни  5  %

Как  видно  из  представленных  снимков,  качественная  реакция  на  определение  присутствия  посторенней  примеси  сока  прошла  успешно  во  всех  случаях,  что  подтвердило  возможность  выявления  факта  добавления  постороннего  сока  в  концентрации  до  5  %.

Выводы

Праймеры  PruC2m  специфичны  только  к  соку  черешни,  UDAp-404  специфичны  только  абрикосовому  соку,  а  UDP96-003  к  соку  из  вишни.  Праймеры  UDP98-022  проявляют  специфичность  одновременно  к  сокам  из  персика,  нектарина,  вишни  и  черешни,  UDP98–024  одновременно  к  сокам  из  абрикоса  и  персика,  UDP96-001  проявляет  специфичность  к  сокам  из  персика  нектарина  и  вишни. 

Во  всех  случаях  оптимизированная  температура  отжига  праймера  превышает  на  1—6  °C  температуру  отжига,  приведённую  в  источниках.

Качественная  реакция  на  выявление  примеси  постороннего  сока  в  объёме  5  %  показала  возможность  применения  ПЦР  для  выявления  фальсификации,  связанной  с  недопустимой  модификацией  сырьевого  состава  соков.  Праймеры  PruC2m  и  UDP96-003,  соответственно,  способны  идентифицировать  примесь  сока  черешни  и  вишни  в  гранатовом  соке.  Пара  праймеров  UDAp-404  способна  выявлять  нарушения,  связанные  с  внесением  доли  абрикосового  сока  в  сок  персика.

Список  литературы:

1.ГОСТ  Р  53137-2008  «Соки  и  соковая  продукция.  Идентификация.  Общие  положения»  //  М.:  Госстандарт  России,  2008.

2.Российский  рынок  соков  2013  —  «Противоречия  и  прогнозы»:  аналит.  обзор,  май  2013,  Euroresearch  &  Сonsulting.  [Электронный  ресурс]  —  Режим  доступа.  —  URL:  http:  //er-cons.ru/shop/56/desc/rossijskij-rynok-sokov-protivorechija-i-prognozy  (дата  обращения  10.09.2013).

3.Самойлов  А.В.  Выявление  фальсификации  фруктовых  соков  молекулярно-генетическимим  методами  /  А.В.  Самойлов,  Е.Ю.  Колпаков,  Н.В.  Кирбаева  //  Сборник  научных  трудов  6-ой  конференции  молодых  учёных  отделения  хранения  и  переработки  сельскохозяйственной  продукции  М.:  Издательство  РГАУ  —  МСХА,  2012.  —  С.  281—286.

4.Федеральный  закон  от  27  октября  2008  г.  №  178–ФЗ  «Технический  регламент  на  соковую  продукцию  из  фруктов  и  овощей».

5.Berindean  Ioana  Virginia  /  PCR  Protocol  Optimization  for  Genetic  Diversity  Assessment  and  Molecular.  Characterization  of  Sour  Cherry  Cultivars  /  Ioana  Virginia  Berindean,  Eugen  Cardei,  Gabriela  Roman  Monicasturzeanu,  Doru  Pamful  //  Bulletin  UASVM  Horticulture.  —  2012.  —  Vol.  69.  —  №  1.  —  P.  1843—5394.

6.Cipriani  G.  AC/GT  and  AG/CT  microsatellite  repeats  in  peach  (Prunus  persica  (L)  Batsch):  isolation,  characterization  and  cross-species  amplification  in  Prunus.  /  G.  Cipriani  G.  W.-G.  Lot,  M.  T.  Huang,  et  all.  //  Theor.  Appl.  Genet.  —  1999.  —  №  99.  —  P.  65—72.

7.Hongxia  Wang.  Identification  of  the  S-genotypes  of  several  sweet  cherry  (Prunus  avium  L.)  cultivars  by  AS-PCR  and  pollination  /  Wang  Hongxia,  Zhang  KaiChun,  Su  Huairui  and  Naihaoye  //  African  J.  of  Agricultural  Research.  2010.  —  Vol.  5.  —  №  3.  —  P.  250—256.

8.Messina  R.  New  set  of  microsatellite  loci  isolated  in  apricot  /  R.  Messina,  O.  Lain,  M.T.  Marrazzo,  et  all.  //  Mol.  Ecol.  Notes.  —  2004.  —  Vol.  4.  —  №  3.  —  P.  432—434.

9.Prunus.  The  Plant  List.  Version  1.  2010.  Retrieved  29  November  2012.

10.Suggs  S.V.  Using  purified  genes,  ICN-UCLA  /  S.V.  Suggs,  T.  Hirose,  D.H.  Myake,  M.J.  Kawashima,  et  all.  //  Symp.  Mol.  Cell.  Biol.  —  1981.  —  Vol.  23.  —  P.  683—693.

11.Testolin  R.  Microsatellite  DNA  in  peach  (Prunus  persica  L.  Batsch)  and  its  use  in  fingerprinting  and  testing  the  genetic  origin  of  cultivar  /  R.  Testolin,  T.  Marrazzo,  G.  Cipriani,  et  all.  //  Genome  —  2000.  —  Vol.  43.  —  №  3.  —  P.  512—520.