О РОЛИ ХОЛИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ В РЕГУЛЯЦИИ ЧИСЛЕННОСТИ ПОПУЛЯЦИИ ПОЧВЕННОЙ НЕМАТОДЫ Caenorhabditis briggsae

ON THE ROLE OF CHOLINERGIC SYSTEM IN REGULATION OF POPULATION DENSITY OF SOIL NEMATODE Caenorhabditis briggsae

Tatiana Kalinnikova

phD in Physiology, Senior Researcher of the Laboratory of Experimental Ecology in the Research Institute for Problems of Ecology and Mineral Wealth Use of Tatarstan Academy of Sciences,

Russia, Republic of Tatarstan, Kazan

Evgenia Belova

researcher of the Laboratory of Experimental Ecology in the Research Institute for Problems of Ecology and Mineral Wealth Use of Tatarstan Academy of Sciences,

Russia, Republic of Tatarstan, Kazan

Rufina Kolsanova

phD in Ecology, Researcher of the Laboratory of Experimental Ecology in the Research Institute for Problems of Ecology and Mineral Wealth Use of Tatarstan Academy of Sciences,

Russia, Republic of Tatarstan, Kazan

Marat Gainutdinov

professor, DPhil in Biophysics, Head of the Laboratory of Experimental Ecology in the Research Institute for Problems of Ecology and Mineral Wealth Use of Tatarstan Academy of Sciences,

Russia, Republic of Tatarstan, Kazan

АННОТАЦИЯ

Целью работы явилось исследование влияния высокой численности особей в лабораторной популяции на холинергическую систему почвенной нематоды Caenorhabditis briggsae. Показано, что превышение оптимальной плотности особей в лабораторной популяции активирует холинергическую систему C. briggsae. Эта активация обусловлена сенситизацией никотиновых рецепторов ацетилхолина.

ABSTRACT

The aim of this work was to study possible influence of high population density in laboratory population on cholinergic system of soil nematode Caenorhabditis briggsae. It is shown that the excess over optimal population density activates cholinergic system of C. briggsae. This activation is a consequence of sensitization of nicotinic acetylcholine receptors.

Ключевые слова: Caenorhabditis briggsae; регуляция численности; никотиновые рецепторы ацетилхолина; никотин; левамизол; алдикарб; высокая плотность популяций.

Keywords: Caenorhabditis briggsae; regulation of population size; nicotinic acetylcholine receptors; nicotine; levamisole; aldicarb; high population density.

Популяции животных являются сложными биологическими системами, в которых поведение и физиологическое состояние особей регулируется естественным отбором, социальными сигналами и внутривидовой конкуренцией. Моделирование процессов, происходящих в популяциях животных в природе, является чрезвычайно сложной проблемой из-за ограниченной численности большинства лабораторных популяций животных. Поэтому перспективными моделями для изучения популяций животных в лаборатории являются свободноживущие почвенные нематоды рода Caenorhabditis. Во-первых, из-за микроскопических размеров тела (≈ 1 мм) численность лабораторных популяций этих животных необычайно высока – не менее 10000 особей в чашке Петри диаметром 100 мм. Во-вторых, популяции этих нематод на 99,95 % состоят из самооплодотворяющихся гермафродитов, что позволяет не учитывать половые в эксперименте. В-третьих, из-за высокой скорости развития (менее трех суток при температуре 21°C) и большого количества потомков у одной особи (до 300 потомков у одного гермафродита) численность и возрастная структура нематод рода Caenorhabditis изменяется чрезвычайно быстро. Известно, что популяции животных регулируют свою численность, и эта регуляция включает в себя действие социальных сигналов на поведение, размножение и развитие [6; 7]. Ключевую роль во всех процессах регуляции численности лабораторных популяций нематод играет нервная система [6]. Холинергическая система принимает участие в регуляции всех основных функций организмов человека и животных [4; 5]. Известна и роль холинергической системы в регуляции процессов развития нематод в условиях превышения оптимальной численности их лабораторных популяций [6], но остается открытым вопрос о том, как высокая численность популяций нематод изменяет функции холинергической системы половозрелых особей. Ранее нами было показано, что высокая численность особей вызывает активацию холинергической системы Caenorhabditis elegans, которая проявляется умеренно при оптимальной температуре среды и сильно в условиях теплового стресса [1]. Целью этой работы явилось исследование влияния высокой численности особей в лабораторной популяции на холинергическую систему почвенной нематоды Caenorhabditis briggsae – другого представителя рода Caenorhabditis, генетически близкого C. elegans.

Методы и материалы

Эксперименты проводили с C.briggsae линии дикого типа AF16, предоставленной Caenorhabditis Genetics Center. Нематод выращивали при 21°C в чашках Петри со стандартной средой выращивания нематод (СВН) и E.coli OP50 для кормления [2]. Нематод двухдневного возраста трижды отмывали 10 мл NG буфера (0,3 % NaCl, 1 мМ CaCl₂, 1 мМ MgSO₄, 25 мМ калийфосфатного буфера (pH 7,0)) и переносили в чашки Петри диаметром 40 мм с агаром и E.coli по 200, 700 или 1200 нематод на чашку. Нематод в чашках инкубировали 30 часов при 21°C. После этого отбирали взрослых нематод, трижды отмывали их 10 мл NG буфера и переносили индивидуально в пробирки с 1 мл NG буфера, в которые добавляли левамизола гидрохлорид, никотина гемисульфат или алдикарб. Нарушения поведения, вызванные действием агонистов н-холинорецепторов или алдикарба, регистрировали через 15 минут с использованием стереоскопического микроскопа SMZ-05. Показателем действия левамизола, никотина и алдикарба на поведение C.elegans являлось нарушение моторной программы плавания, индуцированного механическим стимулом (встряхивание пробирки с червем). Эти нарушения проявлялись в нарушениях координации мышц, необходимой для синусоидальных движений тела, временной приостановке плавания и плавании по кругу. В каждом варианте эксперимента использовано 30 червей. Эксперименты проводили в трех повторностях. Статистическую обработку результатов проводили с использованием углового преобразования Фишера φ*. В работе использовали реактивы фирмы Sigma.

Результаты и обсуждение

Эксперименты проводили с особями из лабораторных популяций C. briggsae с различной численностью. C. briggsae отличается более высокой скоростью развития, чем C. elegans – 48 часов при температуре 21°C. Поэтому через 30 часов переноса 200, 700 или 1500 молодых половозрелых особей в чашки Петри диаметром 40 мм, содержащие СВН и E.coli, популяции состояли из особей-основателей и их потомков (личинок I, II и III возраста). Эксперименты проводили только с взрослыми особями-основателями популяций.

В экспериментах с интактными организмами животных изменения центральных процессов в холинергической системе, как грызунов, так и нематод, вызванные стрессовыми условиями среды или мутациями генов, регулирующих процессы холинергической синаптической передачи, оцениваются с помощью фармакологического анализа изменений различных форм поведения, индуцированных действием ингибиторов ацетилхолинэстеразы (АХ-эстеразы) или агонистов и антагонистов рецепторов ацетилхолина. В отличие от экспериментов с грызунами, в которых лекарственные вещества вводят в их головной мозг [4], в экспериментах с C. elegans и C. briggsae как ингибиторы АХ-эстеразы, так и агонисты рецепторов ацетилхолина добавляют в среду инкубации нематод [1; 3]. Это возможно благодаря отсутствию у нематод гематоневрального барьера, поэтому простая холинергическая система нематод регулирует как центральные, так и периферические процессы в организме. Этот подход был использован и в наших экспериментах с C. briggsae.

Таблица 1.

Влияние плотности особей в популяциях Caenorhabditis briggsae на чувствительность поведения нематод к левамизолу и никотину

Примечание: *** – достоверность разницы между контролем (низкая численность особей) и опытом (средняя и высокая численность особей)

*** – p < 0,001

Как показано в таблице 1, введение в среду агонистов никотиновых рецепторов ацетилхолина (н-холинорецепторов) нематод левамизола и никотина вызывает нарушения моторной программы плавания червей, которая проявляется в зависимости от концентрации левамизола и никотина в нарушениях координации мышц, необходимой для синусоидальных движений тела, временной приостановке плавания и плавании по кругу. Эти нарушения поведения нематод, индуцированные левамизолом и никотином, являются следствием гиперактивации н-холинорецепторов в нейронах, принимающих участие в плавании червей, индуцированном механическим стимулом. Факторами, определяющими степень этой гиперактивации н-холинорецепторов, выявляющейся в нарушениях поведения C. briggsae, являются концентрация вещества при фиксированном времени экспозиции и чувствительность к нему н-холинорецепторов.

Как показано в таблице 1, плотность особей в лабораторных популяциях C. briggsae оказывает сильное влияние на чувствительность их поведения к никотину и левамизолу. Это проявляется в снижении концентраций левамизола и никотина, эффективных для нарушения моторной программы плавания C. briggsae, и свидетельствует о том, что превышение оптимальной плотности особей в лабораторной популяции C. briggsae вызывает увеличение чувствительности н-холинорецепторов к их агонистам.

Для проверки предположения о том, что высокая плотность особей в популяции C. briggsae увеличивает чувствительность н-холинорецепторов не только к левамизолу и никотину были проведены эксперименты, в которых сравнивалась чувствительность особей из популяций с различающейся плотностью к ингибитору АХ-эстеразы алдикарбу. Известно, что частичное ингибирование АХ-эстеразы алдикарбом вызывает увеличение концентрации ацетилхолина в синаптической щели, следствиями которого являются гиперактивация н-холинорецепторов и нарушения поведения нематод. Как показано в таблице 2, увеличение плотности особей в лабораторных популяциях C. briggsae вызывает повышение чувствительности поведения C. briggsae к алдикарбу. В связи с тем, что высокая плотность особей вызывает сенситизацию н-холинорецепторов (табл. 1), очевидно, что это увеличение чувствительности поведения к алдикарбу обусловлено не стимуляцией секреции ацетилхолина, а увеличением чувствительности н-холинорецепторов к ацетилхолину.

Таблица 2.

Влияние плотности особей в популяциях Caenorhabditis briggsae на чувствительность поведения нематод к алдикарбу

Примечание: *** – достоверность разницы между контролем (низкая численность особей) и опытом (средняя и высокая численность особей)

*** – p < 0,001

В целом результаты наших экспериментов свидетельствуют о том, что превышение оптимальной плотности особей в лабораторных популяциях C. briggsae активирует холинергическую систему сенситизацией н-холинорецепторов. Одним из известных механизмов регуляции численности популяций животных является миграция особей из местообитаний с локальной высокой плотностью. Этот механизм функционирует и у нематод рода Caenorhabditis. В связи с тем, что ацетилхолин является возбуждающим нейротрансмиттером в регуляции локомоции нематод [5], очевидно, что активация холинергической системы высокой плотностью особей является составной частью формирования такой формы поведения, как избегание локальных сред с высокой плотностью особей C. briggsae. Двумя возможными причинами активации холинергической системы C. briggsae высокой плотностью особей являются увеличение концентрации феромонов и дефицит пищевых ресурсов. Более вероятной является первая из причин, так как E.coli присутствуют на агаре и после 30-часовой инкубации нематод при высокой плотности, а действие феромонов является причиной перехода личинок II возраста в диапаузу и формирования реакции избегания при высокой плотности у нематод близкородственного C. briggsae вида – C. elegans. Результаты работы позволяют сделать вывод о том, что регуляция численности популяций C. briggsae включает в себя активацию холинергической системы.

Список литературы:

1. Колсанова Р.Р., Белова Е.Б., Гайнутдинов М.Х., Калинникова Т.Б. Сенситизация н-холинорецепторов как новый механизм адаптации почвенной нематоды Caenorhabditis elegans к действию теплового стресса и высокой плотности особей в популяции // Сборник научных трудов Института проблем экологии и недропользования АН РТ. Казань: Отечество, 2014. С. 134–145.
2. Brenner S. The genetics of Caenorhabditis elegans // Genetics. 1974. V. 77. P. 71–94.
3. Jospin M., Qi Y.B., Stawicki T.M., Boulin T., Schuske K.R., Horvitz R., Bessereau J.-L., Jorgensen E.M., Jin Y.A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caenorhabditis elegans // PLoS Biology. 2009. V. 7. P. e1000265.
4. Mineur Y.S., Obayemi A., Wigestrand M.B., Fote G.M., Calarco C.A., Li A.M. Picciotto M.R. Cholinergic signaling in the hippocampus regulates social stress resilience and anxiety- and depression-like behavior // PNAS. 2013. V. 110. P. 3573–3578.
5. Rand J.B. Acetylcholine // Wormbook / ed. The C. elegans Research Community, Wormbook. 2007. URL: http://www.wormbook.org (Дата обращения 04.04.2016).
6. Riddle D.L., Albert P.S. Genetic and environmental regulation of dauer larva development // In: C.elegans II / Eds. D.L. Riddle, T. Blumenthal, B.J. Meyer, J.R. Priess. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997. P. 739–768.
7. Wilson E.O. Sociobiology The new synthesis. – Cambridge, MA: The Belknap Press of Harvard University Press, 1975. 697 p.