СЕЛЕКТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ ГЕПАРИНА НА ТОКСИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЯДОВ ЖИВОТНЫХ, ОТНОСЯЩИХСЯ К РАЗНЫМ ТАКСОНОМИЧЕСКИМ ГРУППАМ

Хомутов Александр Евгеньевич

д-р биол. наук., профессор ННГУ, г. Н. Новгород

Малиновская Светлана Львовна

д-р биол. наук., доцент НГМА, г. Н. Новгород

E-mail: sun@gma.nnov.ru

Звонкова Мария Борисовна

канд. биол. наук, доцент НГПУ, г. Н. Новгород

Малиновский Дмитрий Сергеевич

аспирант ННГУ, г. Н. Новгород

Давно исследуется влияние гепарина на физиологические эффекты зоотоксинов. Впервые в 1946 г. гепарин был применен против яда гадюки Рассела [11]. Гепарин нейтрализовал действие на кролика токсических доз, повышая выживаемость, противодействовал гемокоагулирующему эффекту яда V. russelli, Bothropsalternata, B. atrox, B. jararacussi, B. cortiara, но не эффективен против яда Crotalusterrificusи родственной ей австралийской змеи Nothechisscutatus [11]. Гепарин нейтрализует invitroи invivoяд среднеазиатской гюрзы, устраняет его гемокоагулирующее действие, нормализует дыхание и артериальное давление [1, 4, 5].

Гепарин снижает токсические эффекты (гипотензию, брадикардию, аритмии, нейтропению, тромбоцитопению, активацию комплемента, гемолиз, отеки и др.) ядов различных видов кобр [5, 7] и блокирует патогенетическое действие его компонентов - фосфолипазы А₂ и кардиотоксина, с которыми связывается с высокой специфичностью [11].

Гепарин предотвращает развитие острого легочного отека, вызванного ядом скорпиона Tityus serrulatus, но не снимает гипертензивные эффекты яда. Возможно, это связано со способностью гепарина уменьшать сосудистую проницаемость в легких [6].

Гепарин снижает токсические эффекты пчелиного яда [2], ослабляет действие основных его компонентов: мелиттина, апамина, лецитазы А, с которыми он образует комплексы [8, 9]. Гепарин тормозит гемолиз, обусловленный пчелиным ядом и ядом кобры. Это антигемолитическое действие объясняют блокированием имеющегося в яде фермента лецитазы А [10].

Ноотропное действие антикоагулянта изучалось на кафедре физиологии в 1972 году. Б. Н. Орлов и Д. Б. Гелашвили [5] показали, что предварительное введение кошкам больших доз гепарина предотвращало угнетение первичных ответов коры при прямой аппликации яда кобры на поверхность соматосенсорной зоны. Этот эффект авторы связывают с защитой гепарином деполяризующих синапсов коры, на которые в условиях прямой аппликации оказывает преимущественное влияние яд кобры.

Тем не менее, сведения об антидотном действии гепарина в отношении зоотоксинов фрагментарны, часто противоречивы и не носят сравнительного характера, в связи с чем была выполнена настоящая работа.

Экспериментальная часть исследования была выполнена на мышах массой 18‑20 г. В работе использовались яды животных различных таксономических групп — пчелы медоносной (Apis mellifera L.), представителя насекомых (Insecta); скорпиона пестрого (Butus eupeus C. Koch), относящегося к классу паукообразных (Arachnida); жабы зеленой (Bufoviridis L.), представляющей бесхвостых земноводных (Anura); саламандры пятристой (Salamandrasalamandra L.), относящейся к отряду хвостатых земноводных (Urodela) ; кобры среднеазиатской (Naja oxiana Eichw.), эфы песчаной (Echis carinatus Schneid), гюрзы среднеазиатской (Vipera lebetina L.), гадюки обыкновенной (Vipera berus L.), щитомордника восточного (Agkistrodon blomhoffiBoie), относящихся к классу рептилий (Reptilia).

Исследуемые вещества разводились в изотоническом растворе хлорида натрия и вводились животным в возрастающих количествах. ДЛ₅₀ определяли расчётным путём. ДЛ₁₀₀ соответствовало дозе яда, при введении которой в течение суток погибали все экспериментальные животные. Влияние гепарина на токсичность ядов животных определяли в аналогичных экспериментах, вводя животным смеси гепарина с зоотоксинами в различных соотношениях, а также яды на фоне предварительной гепаринизации (за 10 минут до введения зоотоксина) и гепарин через 10 минут после интоксикации.

Пчелиный яд в дозе 7.0±0.9 мг/кг вызывал гибель 50% экспериментальных животных (ДЛ₅₀). Предварительная инкубация пчелиного яда с гепарином приводила к значительному ослаблению его токсических свойств. Так, при соотношении компонентов смеси яд-гепарин 2:1, ДЛ₅₀ возрастала примерно в 2.5 раза (до 17.4±1.8 мг/кг), а при увеличении количества гепарина в смеси в 10 раз была вдвое выше, чем в контроле — 14.1±1.2 мг/кг (табл. 1).

Таблица 1.

Влияние экзогенного и эндогенного гепарина на токсические свойства пчелиного яда

* - Различия между контрольными и экспериментальными группами статистически значимы (р≤ 0,05)

Доза, вызывающая в эксперименте гибель всех мышей (ДЛ₁₀₀), равнялась 13.0 мг/кг для чистого пчелиного яда. При добавлении к зоотоксину гепарина в соотношении яд-гепарин 1:0.5 ДЛ₁₀₀ возрастала до 25±3.4 мг/кг, а при соотношении компонентов смеси 1:5 была несколько ниже (19.0±2.1), но, тем не менее, значительно превышала контрольные значения (табл. 1).

Блокирование эндогенного гепарина его антагонистом протамин сульфатом вызывало заметное увеличение токсичности пчелиного яда, ДЛ₅₀ в этом случае составила 5.1±0.3 мг/кг (табл. 1).

Доза пчелиного яда, вызывающая в эксперименте гибель всех мышей (ДЛ₁₀₀), равнялась 13.0 мг/кг. При добавлении к зоотоксину гепарина в соотношении яд-гепарин 2:1 ДЛ₁₀₀ возрастала до 25 мг/кг, а при соотношении компонентов смеси 2:10 была несколько ниже (19.0), но, тем не менее, значительно превышала контрольные значения (табл. 1). Блокирование эндогенного гепарина его антагонистом протамин сульфатом вызывало заметное увеличение токсичности пчелиного яда, ДЛ₅₀ в этом случае составила 5.1±0.3 мг/кг (табл. 1).

Ввиду отсутствия усиления протекторного действия гепарина с увеличением его дозы была предпринята попытка выяснить оптимальные соотношения компонентов в смеси яд-гепарин. Действительно, при предварительной инкубации с пчелиным ядом гепарин в различных соотношениях вызывал заметное ослабление его токсичности. При введении животным летальной дозы (ДЛ₁₀₀) пчелиного яда в контроле все животные погибали. При инъекции животным смеси яд-гепарин в соотношениях 1:0.05; 1:0.5 и 1:5 выживаемость мышей была соответственно 33, 75 и 50%.

Таким образом, максимальный защитный эффект гепарина проявлялся при определенном соотношении компонентов, тогда как при увеличении и уменьшении количества гепарина в смеси его антидотные свойства ослаблялись.

Антидотное действие гепарина проявлялось не только при моделировании взаимодействия с пчелиным ядом invitro(приготовле­ние смеси), но и при предварительном инъецировании его лаборатор­ным животным. Введение 5, 50, 500 и 5000 МЕ/кг гепарина мышам за 10 минут до инъекции летальной дозы яда способствовало выживанию соответственно 18, 68, 35 и 26% экспериментальных животных.

Кроме того, гепарин оказывал не менее сильное защитное действие даже при его поступлении в организм на фоне действия яда. При инъекции тех же доз гепарина через 10 минут после введения пчелиного яда в эксперименте выживало 15, 60, 50 и 40% мышей соответственно. Как и в случае введения животным смеси яд-гепарин, максимальный протективный эффект наблюдался при определенной дозе гепарина. В наших экспериментах эта доза была 50 МЕ/кг, при десятикратном увеличении или уменьшении количества гепарина выживаемость животных заметно уменьшалась.

Яд скорпиона в дозе 0.37±0.01 мг/кг вызывал гибель 50% экспериментальных животных (ДЛ₅₀). Внутрибрюшинное введение смеси, полученной invitro, сопровождалось достоверным увеличением ДЛ₅₀ до 0.85±0.03 мг/кг (табл. 2).

Таблица 2.

Влияние экзогенного и эндогенного гепарина на токсические свойства яда скорпиона

* — Различия между контрольными и экспериментальными группами статистически значимы (р≤0,05)

Введение яда скорпиона в доле 0.72 мг/кг (ДЛ₁₀₀) сопровождалось гибелью всей группы экспериментальных животных в течение суток. Однако инъекция инкубированной смеси яд-гепарин повышало величину ДЛ₁₀₀ до 1.64±0.1 мг/кг. Иная картина наблюдалась при предварительном введении протамин сульфата. В этом случае ДЛ₅₀ снижалась до 0.21±0.01 мг/кг (табл. 2).

Яд кобры в наших экспериментах обладал наибольшей токсичностью, относительно других змеиных ядов. Доза, вызывающая гибель 50% мышей (ДЛ₅₀), равнялась 0.6±0.08 мг/кг (табл. 3). 

Введение мышам летальной дозы (ДЛ₁₀₀)яда кобры вызывало гибель всех экспериментальных животных. Предварительная инкубация яда с гепарином способствовала выживанию мышей. При инъекции животным смеси яд-гепарин в соотношении 1:0.05; 1:0.5 и 1:5 в эксперименте осталось в живых 66, 41 и 33% мышей соответственно (табл. 3).

Инъекция гепарина мышам в различных дозах, также как и при введении яда пчелы, приводила к уменьшению токсичности яда кобры. Предварительное введение гепарина в дозах 5, 50, 500 и 5000 МЕ/кг способствовало выживаемости соответственно 55, 45, 40 и 25% животных, получивших инъекцию ДЛ₁₀₀ яда (табл. 3).

Таблица 3.

Влияние экзогенного и эндогенного гепарина на токсические свойства яда кобры

* — Различия между контрольными и экспериментальными группами статистически значимы (р≤0,05)

Яд гюрзы вызывал гибель 50% белых мышей в дозе 2.8±0.7 мг/кг. Предварительная инкубация яда гюрзы с гепарином приводила к заметному ослаблению его токсических свойств. Гепарин уже в минимальных количествах (соотношение яд-гепарин в смеси 1:0.005) вызывал двукратное увеличение ДЛ₅₀, которая составила в этом случае 5.8±0.2 мг/кг. Однако увеличение содержания гепарина в смеси было малоэффективным, и при соотношении компонентов смеси 1:0.05 ДЛ₅₀ возрастала только до 4.2±0.7 мг/кг по сравнению с контролем (табл. 4).

Таблица 4.

Влияние экзогенного и эндогенного гепарина на токсические свойства яда гюрзы

* - Различия между контрольными и экспериментальными  группами статистически значимы (р≤0,05)

Доза яда, гюрзы вызывающая гибель 100% экспериментальных животных (ДЛ₁₀₀), также зависела от количества гепарина в смеси яд-гепарин. Так, летальная доза чистого яда гюрзы была 6.0 мг/кг, а смеси яд-гепарин возрастала до 12.3±0.6 и 9.4±0.6 мг/кг при соотношении компонентов смеси 1:0.005 и 1:0.05 соответственно. Нейтрализация эндогенного гепарина протамин сульфатом приводила к существенному увеличению токсичности яда гюрзы, ДЛ₅₀ в этом опыте была 1.8±0.4 мг/кг (табл. 4).

Аналогичная тенденция антидотного действия гепарина наблюдалась и при введении смеси яд эфы-гепарин. Также как и в случае с введением яда гюрзы отмечается оптимум весовых соотношений, при котором регистрируется максимальный эффект. Увеличение или уменьшение концентрации гепарина в смеси сопровождается снижением антидотного действия протеоликана.

Иная картина наблюдается при изучении антидотного действия гепарина при введении яда щитомордника (табл. 5).

Доза яда, соответствующая 50%-ной гибели мышей, равнялась 10.2±1.1 мг/кг. Гепарин, добавленный к яду в различных соотношениях, не оказывал влияния на выживаемость животных. ДЛ₅₀ смеси яда щитомордника с гепарином при соотношениях 1:0.05, 1:0.5 и 1:5 практически не отличалась от контроля и равнялась 10.4±1.4, 9.8±0.8 и 10.2±2.2 мг/кг соответственно (табл. 5).

Таблица 5.

Влияние экзогенного и эндогенного гепарина на токсические свойства яда щитомордника

* - Различия между контрольными и экспериментальными группами статистически значимы (р≤0,05)

Доза яда, вызывающая в эксперименте гибель всех мышей (ДЛ₁₀₀), была 20.0 мг/кг. Инъецирование животным смеси яд-гепарин не изменяло токсичности яда, и ДЛ₁₀₀ оставалась на том же уровне: ее значения в опытах равнялись 18.6±2.1, 19.2±1.8 и 18.2±1.7 мг/кг при соотношении компонентов смеси 1:0.05, 1:0.5 и 1:5 соответственно. Протамин сульфат, инактивирующий эндогенный гепарин, также не влиял на токсичность яда щитомордника, ДЛ₅₀ в этом случае имела значение 9.9±0.8 мг/кг (табл. 5).

Таким образом, гепарин, в отличие от вышеописанных зоотоксинов, не влияет на токсические свойства яда щитомордника. Сходная картина наблюдается при сочетанном применении жабьего яда и яда саламандры.

Жабий яд в наших экспериментах вызывал гибель 50% животных (ДЛ₅₀) в дозе 4.7±0.2 мг/кг. Предварительная инкубация жабьего яда с гепарином не влияла на его токсичность. ДЛ₅₀ смеси яд-гепарин при соотношении ее компонентов 1:0.05, 1:0.5 и 1:5 оставалась практически на том же уровне и равнялась 4.2±0.3, 4.5±0.4 и 5.0±0.6 мг/кг соответственно.

Доза жабьего яда, приводящая к гибели 100% мышей (ДЛ₁₀₀), была 8.0 мг/кг. ДЛ₁₀₀ смеси яд-гепарин в тех же соотношениях не отличалась от контроля и составила 8.0±0.6, 8.1±0.7 и 8.4±0.8 мг/кг соответственно. Жабий яд, введенный на фоне протамин сульфата, не изменял своей активности, его ДЛ₅₀ соответствовала 4.1±0.2 мг/кг.

Взаимоотношения гепарина и яда саламандры строятся по тому же плану, что и с жабьим ядом. Так, ДЛ₅₀ яда саламандры равна 24.6±2.3 мг/кг, а ДЛ₅₀ смеси яд-гепарин в весовом соотношении 2:1 соответственно — 26.4±3.5 мг/кг.

Увеличение дозы яда саламандры до 50.0 мг/кг сопровождается гибелью всей группы экспериментальных животных в течение суток (ДЛ₁₀₀). А инъекция смеси яд-гепарин в том же весовом соотношении достоверно не изменяла величины ДЛ₁₀₀. Протамин сульфат, введённый до яда саламандры, достоверно не изменяет величины ДЛ₅₀.

Таким образом, гепарин в экспериментах на белых мышах обладал выраженными антидотными свойствами по отношению к большинству зоотоксинов, различных по составу и физиологическому действию. Эффективность гепарина, по-видимому, только отчасти объясняется его антикоагулянтными свойствами, так как его защитное действие проявлялось как при совместном введении с типичными гемокоагулирующими зоотоксинами — ядом гюрзы и ядом эфы, так и с нейротропным ядом кобры, и с мембранолитиком — пчелиным ядом. Кроме того, искусственно вызванная гипергепаринемия также способствовала повышению выживаемости животных, отравленных ядами пчелы и кобры. Характерной особенностью гепарина является то, что его максимальный антидотный эффект проявляется в определенной дозе, либо при соотношении компонентов смеси, оптимальных для данного зоотоксина.

В основе механизма антидотного действия гепарина, на наш взгляд, лежит его способность взаимодействовать с белками [3], в результате чего активность белков снижается. Известно, что основными действующими началами большинства зоотоксинов являются полипептиды. В результате взаимодействия с гепарином пчелиного яда, ядов скорпиона, кобры, гюрзы и эфы они частично теряют свои токсические свойства. Яд щитомордника, а именно основное действующее начало — кротоксин, сам по себе уже представляет естественный комплекс двух противоположно заряженных белковых компонентов, удерживающихся на основе кислотно-щелочного взаимодействия [12]. Яд саламандры и жабий яд имеют не белковую, а стероидную структуру [6], в связи с чем они не взаимодействуют с гепарином, а их токсические свойства не снижаются в присутствии протеогликана.

Список литературы:

1.Вальцева И. А. Патофизиологические особенности действия ядов змей, обитающих на территории СССР и некоторые вопросы экспериментальной терапии. М.: Медицина, 1963. — 176 с.

2.Гиноян Р. В., Хомутов А. Е., Лушникова О. В. Продукты пчеловодства и апитерапия. — Н. Новгород: Изд-во ННГУ, 2008. — 648 с.

3.Ляпина Л. А., Пасторова В. Е., Кудряшов Б. А. Комплексные соединения гепарина и их физиологическое значение //Успехи физиол. наук — 1989. — Т.20, №1. — С. 90‑105.

4.Орлов Б. Н., Вальцева И. А.Яды змей. Ташкент: Медицина, 1977. — 252 с.

5.Орлов Б. Н., Гелашвили Д. Б.К вопросу о центральных механизмах нейротропного действия яда кобры // Механизмы действия биологически активных веществ. Горький: Изд-во ГГУ, 1972. — С. 20‑31.

6.Орлов Б. Н., Гелашвили Д. Б.Ибрагимов А. К. Ядовитые животные и растения СССР. М.: Высшая школа, 1990. — 272 с.

7.Хомутов А. Е., Орлов А. В. Влияние гепарина на электрокардиографические характеристики яда кобры //Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины. М.: ММА им. И. М. Сеченова. — 1998. — С. 332‑333.

8.Хомутов А. Е., Орлов А. В., Дерюгина А. В. Средство от ужалений // Пчеловодство — 1999. — №1. — С. 60‑61.

9.Хомутов А. Е., Пурсанов К. А. Биологические и клинические основы апитерапии. Н. Новгород: Изд-во НГМА, 2011. — 400 с.

10.Хомутов А. Е., Пурсанов К. А., Калашникова Л. М. Пчелы, пчелиный яд, апитоксинотерапия. — Н. Новгород: Изд-во НГМА, 2006. — 380 с.

11. Ahuja M. L., Brooks A. G. A note of the action of heparin on Russels viper venom //Jud. J. Mtd. Res. — 1946. — V. 34, N 2. — P. 317‑322.

12.Sahni A. L., Banerjee R. N.Anticoagulation in hemorrhagic snake venom poisoning // Toxins. — 1976. — V. 2. — P. 497‑506.