ВЛИЯНИЕ НИТРАТОВ НА РАЗВИТИЕ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ, ВЫЗВАННЫХ ИШЕМИЕЙ МОЗГА, У КРЫС

Кузенков Виктор Сергеевич

канд. биол. наук., лаборант-инженер I-категории МГУ, г. Москва

Е-mail: kouzenkov@mail.ru

Крушинский Алексей Леонидович

канд. биол. наук., научный сотрудник МГУ, г. Москва

E-mail: krushinsky@pochta.ru

Реутов Валентин Палледиевич

д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник института ВНД и нейрофизиологии РАН, г. Москва

E-mail: valeninreutov@mail.ru

Курилина Татьяна Андреевна

Старший лаборант МГУ, г. Москва

E-mail: k_staty@yahoo.com

Работа поддержана грантом РФФИ № 09-04-00481.

Нитраты применяются в медицине несколько тысячелетий. В средние века они применялись для лечения различных заболеваний: они были предписаны как противогрибковое и антивоспалительное средство, применялись как мочевой антисептик и мочегонное средство, для лечения оспы, бубонной чумы и лихорадки, использовались как успокаивающие агенты против конвульсий, для лечения сердечнососудистых заболеваний [22; 23]. Но, несмотря на тысячелетнюю терапевтическую историю применения нитратов, до сих пор в современном обществе существует неоднозначное отношение к нитратам. Это, прежде всего, связано с демонстрацией канцерогенного эффекта этих веществ и случаями метгемоглобинемии, особенно у младенцев [12; 20].

Нитраты могут поступать в организм не только с пищей и водой, но и образовываться эндогенно. Большие концентрации нитратов, нитритов и оксида азота обнаруживается при многих заболеваниях, особенно при различных патологиях мозга, в частности при инсультах [11; 19]. Эти вещества в организмеспособны участвовать в циклических взаимопревращениях [5; 24]. Оксид азота (NO) может образовываться не только из L-аргинина, но и из ионов NO₂¯, которые восстанавливаются в NO при участии металлсодержащих белков (нитритредуктаз.). Ионы NO₂¯, в свою очередь, могут образовываться путем восстановления ионов NO₃¯ под действием нитратредуктаз [15]. В условиях дефицита кислорода, которым сопровождается ишемия мозга, такой ряд трансформации NO₃¯→NO₂¯→NO протекает особенно интенсивно [9; 18].

Свои повреждающие и терапевтические свойства нитраты и нитриты реализуют в основном через оксид азота, который также образуется эндогенно из аминокислоты L-аргинина под действием NO-синтаз [10]. Оксид азота важный регулятор разнообразных физиологических функций у человека и животных, как в норме, так и патологии [1; 20]. Оксид азота участвует в синаптической передаче, ингибирует агрегацию тромбоцитов, играет роль активного вазодилататора, что особенно важно при ишемии мозга [2; 14]. В условиях избыточного синтеза NO обладает нейротоксическими свойствами [1; 16].

В предыдущих исследованиях нами было установлено, что в зависимости от дозы NO-генерирующего соединения (нитрит натрия) оксид азота может оказывать как защитный так и ухудшающий эффект на развитие стрессорных повреждений у крыс линии КМ в условиях акустической экспозиции [6]. Выше было отмечено, что интенсивное превращение нитратов в нитриты и NOосуществляется в условиях гипоксии/ишемии, которые активируют нитрат/нитритредук­тазы [3; 21]. Но, на активность нитрат/нитритредуктаз влияют также катионы моновалентных и двухвалентных металлов, сопутствующие аниону. Падение нитратредуцирующей активности отмечено в ряду: K⁺, Na⁺, Mg₂⁺, Ca₂⁺, Ba₂⁺ [8]. Поэтому можно предположить, что NO-генерирующие соединения (нитриты и нитраты) могут проявлять противоположные эффекты не только от дозы соединения, но и от катиона, сопутствующего аниону.

Целью настоящей работы явилось сравнительное изучение влияния нитрата калия и нитрата натрия минут до окклюзии 2-х сонных артерий, на динамику неврологических нарушений и смертность животных в результате ишемии мозга, вызванной двухсторонней окклюзией общих сонных артерий.

Материалы и методы исследований

В опытах использовали 75 самцов крыс линии Wistarмассой 100-130 г. Все группы животных составляли крысы с неполной глобальной ишемией мозга. Для создания дефицита кровоснабжения мозга применяли классическую модель неполной глобальной ишемии, вызванной одномоментной двусторонней перевязкой общих сонных артерий [13]. Крысам под эфирным наркозом отсепаровывали и перевязывали общие сонные артерии. Первой опытной группе (KNO₃-50) вводили нитрат калия (KNO₃) в дозе 50 мг/1000 г внутрибрюшинно за 60 минут перед окклюзией 2-х сонных артерий, n=25. Второй опытной группе крыс (NaNO₃-50) вводили нитрат натрия в дозе 50 мг/1000 г внутрибрюшинно за 60 минут до окклюзии 2-х сонных артерий, n=25. Третью группу составляли контрольные животные (контроль), n=25, которым вводили физиологический раствор (0,9% NaCl) в эквивалентном количестве. Длительность операции составляла не более 10 мин., затем крысы быстро восстанавливались после эфирного наркоза. После операции животных помещали в отдельные клетки и визуально оценивали динамику развития неврологического дефицита в баллах по методике бальной оценки неврологического состояния крыс после двухсторонней перевязки общих сонных артерий [7]. Основные признаки неврологических нарушений включали ограничение подвижности животного, птоз, гиперактивное поведение, насильственные движения (вращения, прыжки, судорожные и вращательные припадки), парезы конечностей, кому и смерть. По шкале бальной оценки легкая степень неврологической симптоматики составляет 0-3 баллов (состояние, близкое к норме); средняя степень — 3-6 баллов; тяжелая степень 7-24 балла; 25 баллов — смерть. Неврологический дефицит отдельно взятого животного оценивали через каждые 30 мин в течение 8 часов. Суммарный балл неврологического дефицита по каждому промежутку времени усредняли для всех животных в группе. На основе полученных данных строили графики динамики неврологических нарушений, отложив по оси ординат баллы, по оси ординат — время. Оценку летальности проводили по гистограммам, отражающим процент выживших и умерших животных. Для статического анализа полученных данных по динамике неврологического дефицита использовали непараметрический тест Манна-Уитни с использованием компьютерной программы “Statistika 6”. Для оценки летальности неврологических проявлений применяли критерий Фишера.

Результаты исследований и их обсуждение

Нитрат калия и нитрат натрия оказали разнонаправленное воздействие на ишемию мозга крыс линии Вистар. У животных, которым вводили KNO₃ в дозе 50 мг/1000 г, наблюдалось достоверное (p<0,05) увеличение неврологического дефицита по сравнению с контрольными крысами на временном интервале 370 ‑ 480 мин. (рис. 1). Напротив, у крыс, которым вводили NaNO₃ в дозе 50 мг/1000 г, наблюдалось достоверное (p<0,05) уменьшение неврологической симптоматики по сравнению с контрольными крысами на временном интервале 270‑480 мин. (рис. 1). Динамика неврологических нарушений у крыс 1-й опытной группы по сравнению с крысами 2-й опытной группы было более интенсивной. Так, на временном интервале 210 ‑ 480 мин. интенсивность нарастания неврологического дефицита у крыс 1-й опытной группы было достоверно выше (p<0,01), чем у крыс 2-й группы (рис. 1). Смертность во 2-й опытной группе животных была достоверно ниже (p<0,05), чем в контрольной группе и во 2-й опытной группе (рис. 2).

Рисунок 1. Влияние KNO₃ (50 мг/1000 г) и NaNO₃ (50 мг/1000 г) на развитие неврологических нарушений при неполной глобальной ишемии мозга.

KNO₃-50 — в дозе 50 мг/1000 г, n=25; NaNO₃-50 – NaNO₃ в дозе 50 мг/1000 г, n=25; контроль, n=25; * p<0,05 — достоверность различий между группами KNO₃-50 и контроль, + p<0,01 достоверность различий между группами KNO₃-50 и NaNO₃-50.

Рисунок 2. Влияние KNO₃ (50 мг/1000 г) и NaNO₃ (50 мг/1000 г) на смертность крыс при неполной глобальной ишемии мозга.

KNO₃-50 — в дозе 50 мг/1000 г, n=25; NaNO₃-50 – NaNO₃ в дозе 50 мг/1000 г, n=25; контроль, n=25; * p<0,05 — достоверность различий между группами KNO₃-50 и контроль и между группами KNO₃-50 и NaNO₃-50.

Таким образом, нами было показано разнонаправленное влияние нитрата калия в дозе 50 мг/1000 г и нитрата натрия в дозе 50 мг/1000 г на развитие неврологических нарушений и смертность животных, вызванных одномоментной двусторонней перевязкой общих сонных артерий. Известно, что окклюзия двух сонных артерий вызывает развитие острой церебральной ишемии и запускает каскад патобиохимических реакций в головном мозге, вызывая повреждения нейронов и глии [13]. Протекторное влияние нитрата натрия в дозе 50 мг/1000 г можно объяснить тем, что в условиях гипоксии/ишемии мозга умеренно возрастает ферментативная активность нитратредуктаз и нитритредуктаз, которые осуществляют цепь превращений NO₃¯→NO₂¯→NO [17]. Оксид азота, являясь сильным вазодилататором, способен увеличивать скорость кровотока в мозге, ингибировать агрегацию тромбоцитов [4; 9]. Индуцируется пространственное перераспределение белков из растворимого в мембранно-связанное состояние. При этом может значительно увеличиваться как стабильность этих белков, так и стабильность мембран. Также могут активироваться многие ферментные системы, включая ферменты гликолиза, участвующие в синтезе АТФ [5], что также может снижать последствия ишемии и гипоксии мозга, возникающие в результате перевязки сонных артерий.

Негативное влияние нитрата калия в дозе 50 мг/1000 г вероятно связанно с тем, что ионы калия усиливаютнитрат/нитритредуктазную активность, приводящую к избыточному синтезу NO, приводяшему к усилению образования метгемоглобина, уменьшению кислородной емкости крови [5, 6]. Кроме того усиленное образование оксида азота может способствовать усилению свободно–радикальных процессов и повреждению мембран нервных и эндотелиальных клеток [5]. В результате усиливаются патологические процессы в мозге обусловленные перевязкой сонных артерий.

Список литературы:

1.Каменский А. А., Савельева К. В. Оксид азота и поведение. — 2002. М. 120 с.

2.Крушинский А. Л., Кузенков В. С., Дьяконова В. Е., Реутов В. П. Влияние ингибиторов индуцибельной и нейрональной NO-синтаз на развитие аудиогенных стрессорных повреждений у крыс линии Крушинского-Молодкиной. // Бюлл. эксп. биол. и мед. — 2010. Т. 150. №7 — С. 38‑41.

3.Кузенков В. С., Крушинский А. Л., Реутов В. П.. Влияние нитрата натрия на развитие неврологического дефицита у крыс при неполной глобальной ишемии мозга. // Вестн. Моск. Ун-та. — 2011. Сер.16. Биология. №1 — C. 3‑6.

4.Марков Х. М. Окись азота и окись углерода — новый класс сигнальных молекул. // Успехи физиол. наук. — 1996. Т. 27. №4 — С. 30‑43.

5.Реутов В. П., Сорокина Е. Г. NO-синтазная и нитритредуктазная компоненты цикла оксида азота. // Биохимия. — 1998. Т. 63. №7. —С. 1029‑1040.

6.Реутов В. П., Кузенков В. С., Крушинский А. Л., Кошелев В. Б., Рясина Т. В., Левшина И. П., Шуйкин Н. Н., Косицын Н. С., Айрапетянц М. Г. Развитие стрессорных повреждений у крыс линии Крушинского-Молодкиной, генетически предрасположенных к судорожным припадкам, при действии NO-генерирующего соединения и бокатора NO-синтазы. // Известия НАН Беларуси, сер. мед.-биол. Наук. NewsofBiomedicalSciences. 2002. №1. С. 5‑10.

7.Саркисов К. Ю., Опиц Б., Оеме П. Влияние фрагмента субстанции Р. (3‑4) на течение ишемии мозга у крыс с разным типом поведения. // Бюлл. эксп. биол. и мед. — 1996. Т. 121. №4 — С. 399‑403.

8.Храмов В. А., Комарова В. И., Темкин Э. С. Антибиотики как ингибиторы нитратредуктазы ротовой жидкости человека. // Стоматология. — 2000. №2. — С. 4‑5.

9.Bolan J. P., Almeida A.Roles of nitric oxide in brain hypoxia-ischemia. Review. // Biochimica et Biophysica Acta. —1999. №1411 —С. 415‑436.

10.Bryan N. S. Nitrite in nitric oxide biology: Cause or consequence? A systems-based review. // Free Radic Biol Med. —2006. №41 —С. 691‑701.

11.Chen S. M., Swilley S., Bell R., Rajanna S., Reddy S. L., Rajanna B.. Lead induced alterations in nitrite and nitrate levels in different regions of the rat brain. // Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. — 2000. Т. 125. №3 —С. 315‑323.

12.Hogg N. Biological chemistry and clinical potential of S-nitrosothiols. // Free Radic Biol Med. — 2000. №28 —С. 1478‑1486.

13.Hossmann K. A. Experimental models for the investigation of brain ischemia. // Cariovasc. Res. —1988. №39 —С. 106‑120.

14.Iadecola C. Bright and dark sides of nitric oxide in ischemia brain injury. // Trend. Neurosci. —1997. №20 —С. 132‑139.

15.Jansson E. A, Huang L., Malkey R., Govoni M., Nihlen C., Olsson A., Stensdotter M., Petersson J., Holm L., Weitzberg E., Lundberg J. O.. A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis. // Nat Chem Biol. — 2008. №4 —С. 411‑417.

16.Jung K. H, Chu K., Ko S. Y., Lee S. T., Sinn D. I., Park D. K., Kim J. M., Song E. C., Kim M., Roh J. K.. Early intravenous infusion of sodium nitrite protects brain against in vivo ischemia-reperfusion injury. // Stroke. – 2006. №37 —С. 2744‑2750.

17.Lundberg J. O., Weitzberg E. NOGeneration from Nitrite and Its Role in Vascular Control. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. —2005.№25 —С. 915‑922.

18.Martin H. M., Hancock J. T. Salisbury V. Harrison R. Role of Xantine oxireductase as an antimicrobical agent // Infection and Immunity. — 2004. Т. 72. №9 —С. 4933‑4939.

19.Millar T. M., Stevens C. R., Blake D. R. Xantine oxidase can generate nitric oxide from nitrate in ischemia. // Biochem. Soc. Trans. —1997. Т. 25. №3 —С. 528‑531.

20.Mueller B. A., et al. Household water source and the risk of childhood brain tumours: results of the SEARCH. International Brain Tumor Study. // Int.J.Epidemiol. —2004. Т. 33. №6 —С. 1209‑1216.

21.Moncada S., Palmer R. M. J., Higgs E. A. Nitric oxide: physiology, patophisiology, and pharmacology. // Pharmacol. Rev. —1992. №43. —С. 109‑142.

22.Rao A. M., Dogan A., Hatcher J. F., Dempsey R. J. Fluorometric assay of nitrite and nitrate in brain tissue after traumatic brain injury and cerebral ischemia. // Brain Res. — 1998. Т. 18. №793(1‑2) —С. 265‑70.

23.Webb A J, N. Patel, S. Loukogeorgakis, M. Okorie, Z. Aboud, S. Misra, R. Rashid, P. Miall, J. Deanfield, N. Benjamin, R. MacAllister, A. J. Hobbs, A. Ahluwalia. Acute blood pressure lowering, vasoprotective, and antiplatelet properties of dietary nitrate via bioconversion to nitrite. // Hypertension. – 2008. №51. —С. 784‑790.

24.Yoshida K, Kasama K., Kitabatake M., Imai M. Biotransformation of nitric oxide, nitrite and nitrate. // Int Arch Occup Environ Health. — 1983. №52. —С. 103‑115.