ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ПАТОГЕНЕЗА ВНЕЗАПНОЙ СЕРДЕЧНОЙ СМЕРТИ, МАРКЕРЫ И СПОСОБЫ КОРРЕКЦИИ

Игрунова Ксения Николаевна

д-р мед. наук, руководитель ЦНИЛ, Национальная медицинская академия последипломного образования имени П. Л. Шупика, г. Киев, Ураина

Ватлицов Денис Владимирович

канд. биол. наук, ст. науч. сотр., ЦНИЛ, Национальная медицинская академия последипломного образования имени П. Л. Шупика, г. Киев, Ураина

Андрияш Виктория Васильевна

инженер1 кат., ЦНИЛ, Национальная медицинская академия последипломного образования имени П. Л. Шупика, г. Киев, Ураина

E-mail: cndl@yandex.ru

Введение. В мире наблюдается уменьшение количества смертей от сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), но внезапная сердечная смерть (ВСС) остается очень важной проблемой здравоохранения во всем мире и составляет 60—80 % смертей у больных ишемической болезнью сердца, составляющих 90 % больных ССЗ [10]. Каждый год около 400 000 американцев умирают внезапно, из них около 251 000 - от ВСС. По данным Hohnloser S. [6], ВСС составляет 15—20 % всех ненасильственных случаев смерти среди жителей промышленно развитых стран.

В 1982 году Golgdstein [5] предложил ввести понятие ВСС, куда относили все зарегистрированные случаи смерти, которые наступили в пределах 1 часа с момента появления острых симптомов кардиальной патологии. Несмотря на это, и в настоящее время сохраняются разные подходы при исследовании ВСС, что делает эту проблему «статис­тическим кошмаром». По данным Kuller L. [7], подходы к проблеме ВСС должны включать временной интервал от начала проявления симптомов заболевания, внезапность начала, данные анамнеза, специфичность этиологии заболевания [9]. Simon S. и др. [8], проведя анализ 106 случаев ВСС, предложили 3 предиктора: первичная арит­мия, острая ишемия, и недостаточность насосной функции.

Исходя из вышеприведенного, возникает потребность в разра­ботке концепции развития ВСС, выявлении маркеров развития, прове­дения исследований относительно эффективности прогнозирования рисков возникновения, профилактики и возможности проверки эффективности способов, которые направлены на предотвращение ВСС, а также разработать схемы подбора индивидуальных схем кор­рекции и лечения.

Поэтому целью данного исследования было проведение в эксперименте моделирования ВСС как результата нарушения регуляции баланса жизнеспособности клеток организма, изучение маркеров развития патологии, что дает возможность определения эффективных методов диагностики групп риска и разработки патогенетически направленных средств коррекции ВСС.

Материалы и методы. Эксперимент проводили на 148 поло­возрелых крысах массой 280—310 г возрастом 8—9 месяцев. Все манипуляций проводились в одно и то же время суток. Контрольным материалом служила кровь тех самых крыс до начала эксперимента, отбор материала проводился путем венопункции хвостовой вены.

Разработку метода подбора индивидуальных схем коррекции и контроля лечения in vitro с учетом исходного состояния организма проводили на клиническом материале. Клиническим материалом слу­жили 220 образцов крови больных с различными сердечно-сосудис­тыми заболеваниями.

Состояние клеток организма оценивали по показателям апоптоза и изменений митохондриального мембранного потенциала мононук­леарных клеток крови, отражающих регуляторное влияние нервной и иммунной систем. Для определения уровня апоптоза выделяли моно­нуклеарные клетки крови (МНК) на градиенте плотности фикол-урог­рафин (d=1,077). Для определения апоптоза отбирали по 10⁵ клеток.

Исследование уровня индекса индукции апоптоза (ИИА) МНК проводилось в два этапа: первый — исследование уровня спонтанного апоптоза после культивирования клеток, второй — исследование после добавления в культуральную среду индуктора (индуцированный апоптоз). Определение уровня спонтанного апоптоза даёт возможность определить исходное состояние клеток организма, а исследование индуцированного апотоза выявляет способность клеток противостоять повреждающим факторам. Таким образом, данное исследование дает возможность выявить внутренние повреждения и истощение, не опре­деляемые обычными методами, а именно определить степень исто­щения или функционального резерва клеток организма [2, 3].

Исследование уровня апоптоза проводили на проточном цито­метре PAS (Partec, Германия) с использованием набора для определе­ния апоптоза Annexin V-FITC Apoptosis detection Kit I (BD Bioscience Pharmingen, США).

Определение изменений мембранного потенциала митохондрий (ММП), отражающего энергетический резерв клетки и внутренний механизм запуска апоптоза, проводили по общепринятой методике [4] с родамином 123 («Fluka»).

Математическая обработка полученных результатов проводилась с использованием методов вариационной статистики. Статистическая значимость между групповых расхождений оценивалась по t-критерию Стьюдента [1].

Результаты и их обсуждение. На первом этапе проводилось экспериментальное моделирование и выявление маркеров развития ВСС. Полученные результаты относительно уровня спонтанного и индуцированного апоптоза использованы для расчета индекса индукции апоптоза.

Исследование уровня спонтанного апоптоза выявило стремитель­ное повышение уровня апотпоза с 15,18±1,61 % в контрольном заборе до 25,05±2,86 % после 2 недель иммобилизационного стресса. Потом наблюдалось снижение уровня апотоза до 20,25±3,17 % после 4 недель манипуляций, но введение дополнительной стрессовой нагрузки, гипертермии после иммобилизации, привело к повышению уровня апоптоза МНК до 24,60±2,66 % после 6 недель, то есть на 2 неделю после введения дополнительной стрессовой нагрузки. Дальнейшее стрессирование экспериментальных животных привело к снижению исследуемого параметра до 13,06±5,29 % после 8 недель, что было ниже контрольного значения. После добавления дополнительного стрессорного фактора, повышение активности на фоне гипотермии, на 9 неделе, наблюдалось очередное повышение уровня апоптоза с максимумом после 10 недель 16,61±3,09 %, с последующим сниже­нием. А сроки гибели животных в результате сердечной недостаточ­ности, инфаркта миокарда, что было подтверждено результатами вскрытия, 16,67 % после 1 недели, 20 % после 5 недель и 16,67 % после 12 недель, указывают на зависимость увеличения риска ВСС в периоды пиковых стрессовых нагрузок (рис. 1а).

Исследование уровня индуцированного апоптоза выявило схо­жую картину. Так после 2 недель экспериментального исследования уровень индуцированного апоптоза увеличился до 23,94±2,54 %, что в 2 раза превышало контрольный показатель 11,83±3,53 %, с после­дующим снижением до 12,28±2,78 % после 4 недель и максимумом 24,53±2,63 % после 6 недель (рис. 1б).

а)

б)

Рис. 1 Динамика изменений уровня спонтанного
а) и индуцированного б) апоптоза МНК экспериментальных животных под влиянием длительного иммобилизационно-нагрузочного стресса.

Исследования уровня некроза выявили, что экспериментальное стрессирование практически не влияло на данный показатель и соответствовало контрольному значению 0,51±0,58 % на всех сроках отбора крови.

Результаты, полученные после расчета индекса индукции апоптоза, показали, что избранная модель вызывает изменения функционального резерва клеток организма и приводит в конечном итоге к истощению, которое, в свою очередь, приводит к смерти после увеличения нагрузок и может быть прогнозируемой. Так, было показано, что у крыс возрастом 8—9 месяцев контрольное значение ИИА составляет 1,346±0,286 у. е. и превышает норму 0,500—0,700. Это указывает на то, что у данной группы экспериментальных животных наблюдалось истощение, обусловленное возрастной недостаточ­ностью адаптации. Нашими исследованиями показано, что стресс приводит к активации восстановительных систем клеток организма, что отображается в снижении ИИА до 0,933±0,106 у. е., но также приводит к смерти 16,67 % после 1 недели. Увеличение сроков эксперимента выявило развитие адаптации к стрессу на 4 неделю (1,725±0,477 у. е.), но добавление дополнительной нагрузки привело к резкому снижению ИИА до 0,976±0,059 у. е. и смерти 20 % животных. Результаты, полученные на поздних сроках эксперимента, указывают на истощение и снижение функционального резерва клеток организма (рис. 2).

Рис. 2. Динамика изменений индекса индукции апоптоза мононуклеарных клеток крови экспериментальных животных под влиянием длительного иммобилизационно-нагрузочного стресса.

Проведенные исследования крови крыс, стрессированных согласно предложенной модели, дали возможность выявить точки критических нагрузок, прогнозировать дальнейшие исследования по моделированию ВСС и выявить прогностические маркеры ВСС. Было показано, что исследование индекса индукции апоптоза дает возможность оценить функциональный резерв клеток организма и прогнозировать развитие патологий, а также является чувствительным показателем состояния организма. Таким образом, исходя из результатов экспериментального исследования, которое позволило выявить чувствительный маркер состояния организма, было решено провести исследования возможности коррекции и разработать метод подбора индивидуальных схем коррекции и контроля лечения in vitro с учетом исходного состояния организма.

Было предложено использовать методику оценки функциональ­ного резерва клеток организма для определения эффективности препа­ратов коррекции регулирующих клеточный энергетический обмен. Для этого, в инкубационную среду добавляли препарат коррекции в лечебной концентрации в пересчете на объем среды без изменения концентрации других веществ. До и после этого проводили методику по схеме. Одновременно проводили исследование влияния двух препаратов.

Было показано, что использование обоих препаратов коррекции приводит к снижению уровня как спонтанного, так и индуцированного апоптоза МНК в сравнении с контрольными значениями уровня апоптоза, 22,66±9,90 % спонтанного и 28,07±7,84 % индуцированного соответственно. Причем 1 препарат коррекции в сравнении со 2 пре­паратом приводит к большему снижению уровня спонтанного (19,13±6,52 % и 19,72±6,19 % соответственно), но к меньшему снижению индуцированного апоптоза (27,72±7,52 % и 24,20±6,85 % соответственно) (рис. 3а).

Поскольку существенных различий в уровнях апотоза не было обнаружено, основное внимание обратили на показатели индекса индукции апоптоза. Так было показано, что применение препарата коррекции 1 снижает показатели ИИА до 0,691±0,147 у. е. при том, что исходный показатель был на уровне 0,817±0,259 у. е. и превышал нормальные показатели (0,500—0,700 у. е.). Использование препарата коррекции 2 приводило к увеличению ИИА до 0,878±0,408 у. е. (рис. 3б).

а) 

б) 

Рис. 3. Влияние препаратов коррекции на уровень апоптоза
а) и индекс индукции апоптоза б) МНК больных.

Таким образом, результатами, полученными в ходе исследо­ваний, показано, что использованная в исследованиях модель приво­дит к внезапной сердечной смерти. Также выявлено маркеры, дающие возможность предсказать и оценить риск развития ВСС. Предложен­ные исследовательские приемы по показателям апоптоза, дают воз­можность прогнозировать как риски развития критических состояний, так и быть базовыми для усовершенствования методики точного диагностического алгоритма выявления риска ВСС и индивидуального контроля эффективности лечения сердечно-сосудистых патологий, что приводят к ВСС. На основе проведенных экспериментальных исследований была предложена и опробована методика индивидуаль­ного подбора препаратов коррекции и контроля лечения in vitro.

Список литературы:

1. Гланц С. Медико-биологическая статистика / пер. c англ. М.: Практика, 1999. 459 с.
2. Данченко Е. О. Лабораторные методы оценки апоптоза и некроза // Медицинская панорама (Лабораторная медицина). 1999. N 3. С. 18—19.
3. Ігрунова К. М., Моторна М. М., Степачова Т. І. Апоптоз мононуклеарних клітин крові у хворих з патологією серцево-судинної систем // Лабораторна діагностика. 2004. № 1. C. 16—18.
4. Flow cytometry: a practical approach 3rd edition /University of Oxford ; edited by Michael G. Ormerod. Oxford: Oxford Univ. Press, 2000. 276 p.
5. Goldstein S., Medendorp Sh. V., Landis J. R., Wolfe R. A., Leigtton R., Ritter G., VAsu C. M., Acheson A.: Analysis of cardiac symptoms preceding cardiac arrest // Amer.J.Cardiol. 1986. Vol. 58. N 13. P. 1195—1198.
6. Hohnloser S. H. Der plotzliche Herztod. Diagnostik und Therapie bei Patient mit malignen ventrikularen // Arrhythmien. Therapiwoche. 1988. Vol. 38. N 43. P. 3160—3164.
7. Kuller L. H. Sudden death - definition and epidemiologic consideration // Prog. Cardiovasc. Dis. 1980. Vol. 23. N 1. P. 1—12.
8. Simon S. R., Powel L. H., Bartzokis T. C., Hoch D. H. A new system for classification of cardiac death as arrhythmic, ischemic, or due to myocardial pump failure // Am. J. Cardiol. 1995. Vol 76. N 12. P. 896—898.
9. Topol E. J., Smith J., Plow E. F., Wang Q. K. Genetic susceptibility to myocardial infarction and coronary artery disease // Human Molecular Genetics. 2006. Vol. 15. N 2. P. R117—R123.
10. Zheng Z. J., Croft J. B., Giles W.H., Mensah G. A. Sudden cardiac death in the United States, 1989 to 1998 // Circulation. 2001. Vol. 104. N 18. P. 2158—2163.