РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ КОНКУРЕНТНОГО ВАРИАНТА ИФА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РОТАВИРУСА ГРУППЫ А

Наиболее часто выявляемым этиологическим агентом острых гастроэнтеритов молодняка КРС является ротавирус, который относится к семейству Reoviridae, роду Rotavirus. Ущерб, причиняемый ротавирусами, слагается из отставания в росте и гибели молодняка, особенно ощутим в животноводческих хозяйствах промышленного типа. Результаты проведенных за последниии годы исследований свидетельствуют о широком распространении данной инфекции в хозяйствах РФ[2]. Высокий уровень заболеваемости обусловлен периодической сменой доминирующих G[P]-типов ротавируса группы А, генетическим и антигенным разнообразием циркулирующих штаммов [3].

Важным условием успешной борьбы с инфекцией является своевременная диагностика заболевания с применением различных диагностических методов, в том числе иммуноферментный анализ. Проведение своевременной и точной лабораторной диагностики является важным фактором в борьбе с данными заболеваниями, поскольку этиология возбудителей разнообразна, а клиническая картина относительно одинакова [2].

Для серологической диагностики  в последнее время широко  применяют иммуноферментный анализ (ИФА/ELISA), главными достоинствами которого являются высокая чувствительность, специфичность и экспрессность. Именно конкурентный вариант ИФА требует минимального числа операций, незначительного расхода реагентов и легко может быть автоматизирован [3].

Целью данной работы была разработка конкурентного варианта ИФА для выявления антител к ротавирусу группы А  в сыворотках крови КРС,  свиней и др.

Материалы и методы. Антиген. Для постановки ИФА использовали культуральный диагностический антиген ротавируса группы А, серотип G8P7, штамм «ТЕ-87». Специфическая гипериммунная сыворотка. В работе использовали специфическую гипериммунную поликлональную сыворотку кролика, полученную в результате 3–кратной иммунизации. Антивидовой конъюгат. В качестве антивидового конъюгата использовали иммуноглобулины против IgG кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена (ИЭиМ им. Н.Ф. Гамалеи, Москва или «Sigma»). Исследуемые препараты. Сыворотки крови КРС, свиней, поступившие из различных хозяйств РФ.

Для осуществления поставленной цели применялись следующие методы: культивирование ротавируса КРС, определение титра инфекционности ротавируса КРС, постановка реакции нейтрализации для определения титра вируснейтрализующих антител, получение антигена (низкоскоростным центрифугированием), электрофорез и иммуноблот для оценки степени чистоты и гомогенности концентрированного препарата вируса, измерение концентрации белка, ПЦР-РВ. Постановку ИФА проводили с использованием разработанной тест-системой К-ИФА – «ВНИИЗЖ», а также с использованием коммерческих наборов «INGEZIM ROTA BOVINE» (INGENASA, Испания). Статистическая обработка и анализ полученных данных произведена с использованием методов, описанных Ашмариным И.П., Воробьевым А.А. и Бейли Н.

Результаты. Одним из важных этапов при разработке ИФА является получение активного и специфичного антигена. Для этого выделили и адаптировали в культуре клеток 9 полевых изолятов ротавируса КРС, циркулирующих на территории РФ. После сравнения биологических и молекулярно-генетических свойств изолятов и штаммов ротавируса КРС, находящихся в Коллекции штаммов микроорганизмов (КШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», в качестве антигена для разработки диагностической тест-системы был выбран штамм «TE87» серогруппы А ротавируса КРС, обладающий достаточной инфекционной активностью, группоспецифичностью и наиболее технологичный для наработки производственного антигена.

Специфичность очищенных препаратов антигена ротавируса группы А штамм «ТЕ087» подтверждали методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) (рис. 1).

Рисунок 1. Результаты выявления генома ротавируса КРС в ПЦР-РВ

Для оценки степени чистоты и гомогенности концентрированного препарата вируса использовали электрофорез в 12 % полиакриламидном геле (ПААГ) (Laemmli, 1970 г.). Специфичность полученных компонентов: РВ-антигена и гипериммунной сыворотки кролика подтверждали методом иммуноблота. Для проведения исследований использовали специфические сыворотки крови кролика, полученные на разные штаммы и изоляты ротавируса группы А, а именно: «TE87», «Nebraska»,  «Юрьево-Поле/03/2000». На рис.2  представлены результаты иммуноблотинга.

Рисунок 2. Результаты иммуноблотинга

Как видно из представленных на рисунке 2 данных, все гипериммунные сыворотки кролика, полученные на различные штаммы ротавируса группы А имели одну специфическую область связывания, которая соответствовала белку VP6 (мол.масса - 44кДа). Таким образом, было подтверждено, что сыворотка крови кролика, полученная на диагностический штамм «TE87» обладает межштаммовой группоспецифичностью и ее можно применять в качестве конкурентных антител при постановке К-ИФА. Разработка К-ИФА включала в себя выбор оптимального разведения антигена, специфической гипериммунной сыворотки и антивидового конъюгата, определенные в непрямом варианте ИФА. Учет результатов реакции производился с применением спектрофотометра  «Sunrise» (Tecan, Австрия)  при длине волны 405 нм. С использованием разработанной методики проведено исследование 642 образцов сывороток крови КРС и свиней, поступивших из различных регионов РФ. Разработка новой диагностической тест системы предполагает сравнение полученных в ней данных с результатами, полученными с помощью аналогичного референтного метода. Результаты исследования 203 сывороток крови КРС с помощью двух тест-систем представлены в таблице 2.

Таблица 2

Оценка относительной чувствительностии специфичности разработанной  тест-системы ИФА – «ВНИИЗЖ»

В результате проведенных исследований разработан чувствительный (92 %) и специфичный (94 %) конкурентный вариант ИФА, позволяющий с точностью 92,6 % выявлять антитела к ротавирусу группы А в сыворотках крови КРС и свиней.

Заключение. В результате проведенных исследований разработана диагностическая тест-система для определения специфических антител к ротавирусу группы А в сыворотках крови КРС и свиней, которая может быть использована для проведения скрининговых серологических исследований.

Список литературы:

1. Львов Д.К. Руководство по вирусологии. Вирусы и вирусные инфекции человека и животных. М.: МИА; 2013: 520-522.
2. Сергеев В.А., Непоклонов Е.А., Алипер Т.И. Ротавирусы. Вирусы и вирусные инфекции. М.: Библионика; 2007: 365-369.
3. Estes M.K., Greenberg H.B.  Rotaviruses. In: Knipe D.M., Howley P.M., Fields Virology, 6^th еd. Philadelphia:  Lippincott Williams & Wilkins; 2013. - P. 1347-1401.
4. Tsunemitsu, H. B Detection of group C rotavirus antigens and antibodies in animals and humans by enzyme-linked immunosorbent assays / H.Tsunemitsu, B. Jiang, L.J. Saif  // J. Clin. Microbiol. – 1992. – Vol. 30. – P. 2129-2134.