АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫХ ЧАСТИЦ ЦИНКА

В настоящее время очень остро стоит проблема распространения штаммов с множественной лекарственной устойчивостью [2] и инфицирование ими людей и животных. В связи с этим возникла острая необходимость создания новых средств лечения [1].

Перспективным направлением в разработке новых антимикробных материалов является синтез наночастиц металлов, их соединений и нанокомпозитов на их основе.  В литературных источниках существует очень много данных об уникальных свойствах наночастиц. Но при этом нет единого и полного представления о влиянии метода их синтеза и физико-химических свойствах, определяющихся ими.

Оптимальным способом получения наноструктурированных объектов является ультразвуковая обработка. Данный метод позволяет получать продукты с линейными размерами от 0,001 мкм и выше с пористой поверхностью, диаметры пор последних находятся в пределах от 1 до 100 нм. Используя данный способ, возможно получение панели наноструктурированных частиц с различными физико-химическими свойствами [3]. В результате исследования антимикробных свойств полученных структур можно не только установить их зависимость от размера, формы, площади поверхности и других характеристик частиц, но также подобрать режим синтеза наиболее перспективных наноструктурированных материалов для борьбы с микроорганизмами, в том числе, обладающими устойчивостью к антибиотикам.

В соответствии с вышесказанным целью настоящей работы явилось исследование влияния сонохимической обработки частиц цинка на проявление ими антибактериальных свойств.

Обработка частиц цинкаосуществлялась следующим образом: навески металлов растворяли в дистиллированной воде в соотношении 10 г в 90 мл. Далее 40 мл растворов обрабатывали ультразвуком высокой частоты в  проточной ячейке (FC100L1-1S) (при 65 ° C) при использовании UIP1000hd (Hielscher, Германия) при 20 кГц с максимальной выходной мощностью 1000 Вт. Максимальная интенсивность рассчитывалась как 57 Вт/см² при механической амплитуде 81 мм.

В качестве объектов исследования были использованы частицы Zn, обработанные в течение 10мин, 15мин, 30 мин, 90 мин ультразвуком.

В качестве биологических моделей использовались штаммы: грамположительный — Staphylococcus aureus 209P (ATCC 6538P), грамотрицательная — E.coli 292-116  ATCC.

Для определения способности исследуемых частиц подавлять рост микроорганизмов пользовались методом диффузии в агар. Для этого в ламинарном боксе готовили чашки Петри: заливали их расплавленным агаром в один слой, объемом 20 мл, и давали остыть. После чего на поверхность агара наносили 2,0 мл суспензии ночных культур, предварительно стандартизированных до 10⁶ кл/мл. На высушенные чашки наносили  по 3 мкл растворов частиц металлов с концентрацией 1 г/мл.

После чашки Петри с образцами помещали в термостат с температурой плюс 37°С и вдерживали в течение 16-18 часов. По истечении этого времени снимали показания, измеряя диаметр зоны ингибирования роста и диаметр капли частиц,рассчитывая площадь зоны ингибирования по формуле:

                                                 (1)

где S – площадь зоны ингибирования, мм²; П = 3,14; D – диаметр зоны ингибирования общий, мм; d – диаметр капли частиц, мм.

Для определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) пользовались методом стандартных разведений. Стандартные разведения в 400 мкл готовили по следующей схеме: стандартизированную ночную культуру клеток (10⁶ кл/мл) разливали в микропробирки в количестве 200 мкл, к ним добавляли соответствующее количество предварительно приготовленных растворов частиц, в зависимости от требуемой концентрации их в суспензии. Оставшийся объем дополняли водой. В качестве положительного контроля готовили суспензию ночной культуры объемом 200 мкл и доводили стерильной дистиллированной водой до 400 мкл. В качестве отрицательного контроля выступала питательная среда с водой в соотношении 1:1.

Способность обработанных частиц высвобождатькатионыопределяли титрованием растворов частиц, приготовленных в соотношении 0,01/мл, раствором трилона Б в присутствие Эриохрома черного Т. Для этого отбирали надосадочную жидкость в количестве 500 мкл и титровали трилоном Б до появления синего окрашивания.

Концентрацию частиц определяли по формуле:

,                                                   (2)

где V₂ – объем трилона Б, пошедший на титрование анализируемой пробы; V₁ – объем надосадочной жидкости; С₂ – концентрация трилона Б (0,005 М); С₁ – концентрация ионов Zn²⁺ М.

Формы и размер частиц были получены при помощи SEM.

Результаты антимикробной активности наноструктурированных частиццинка изображены на рисунке 1

Рисунок 1. Площадь зон ингибирования частиц цинка, обработанных в течение 10 мин (1), 15 мин (2), 30 мин (3), 90 мин (4)

На рисунке видно, что частицы, обработанные сонохимически проявляют антимикробную активность как в отношении грамположительных, так и в отношении грамотрицательных бактерий. При этом наибольшую активность частицы цинка проявляют в отношении грамположительных частиц, что объясняется более простым строением клеточной стенки последних по сравнению с грамотрицательными бактериями. Кроме того наблюдается прямая зависимость между временем обработки частиц их антимикробными свойствами.

Зависимость антимикробных свойств растворов металлов, обработаннх УЗ от количества высвобождаемых катионов наглядно представлена на рисунке 2.

Рисунок 2. Зависимость антимикробных свойств растворов частиц цинка, обработанных ультразвуком

Так, видно, что наибольшее количество катионов высвобождается образцом, обработанным ультразвуком в течение 90 минут. Здесь же заметно более интенсивное снижение количества микробных клеток в суспензии.

Для понимания того, как преобразуются частицы в процессе ультразвуковой обработки, были получены снимки при помощи SEM (рисунок 3).

Рисунок 3. Данные форм и размеров частиц цинка, обработанных в течение 10 мин (А), 15 мин (Б), 30 мин (В), 90 мин (Г), полученные при помощи SEM

Видно, что в процессе сонохимической обработки поверхность частиц становится игольчатой. В центре остается ядро, представленное металлической частицей, а вокруг – «иголки», скорее всего представленные оксидом цинка. Понятно, что такая поверхность имеет небольшую площадь соприкосновения с растворителем и свободным радикалами, что в свою очередь влияет на активное образование катионов цинка. Далее в процессе обработки количество иголок сокращается, что связано с увеличенной нагрузкой на частицы в процессе трения. Длинные «иголки» отстают от поверхности. И повышается количество образуемых катионов по сравнению с первым образцом. К 30-ти минутам оболочка в виде иголок практически исчезает, формируется пористая структура с более короткими «иголками». Обработка в течение 90 мин позволяет формировать частицы меньшего размера, имеющие нанопористую структуру, за счет чего увеличивается площадь поверхности, соприкасающейся с растворителем, что создает больше возможностей для контакта со свободными радикалами. Это способствует высвобождению еще большего количества катионов.

Таким образом, метод сонохимической обработки частиц позволяет создавать системы с контролируемыми не только физико-химическими, но и антимикробными свойствами. Также показано, что наибольшей активностью обладают частицы, имеющие сферическую форму и более мелкие поры.

Список литературы:

1. Food and Agriculture Organization of the United Nations. The FAO action plan on antimicrobial resistance 2016-2020. [Электронный ресурс]. –Режим доступа: http://www.who.int/antimicrobial-resistance/publications/global-action-plan/en/,саободный. – (Дата обращения: 30.04.2018).
2. Stankic, S., Suman, S., Haque, F., & Vidic, J. Pure and multi metal oxide nanoparticles: synthesis, antibacterial and cytotoxic properties // Journal of nanobiotechnology/2016.14(1).73. Режим доступа: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27776555  (дата обращения: 01.03.2018).
3. Jana Dulle,a Silke Nemeth,a Ekaterina V. Skorbb and Daria V. Andreeva. Sononanostructuring of zinc-based materials // RSC Advances. Received 18th September 2012, Accepted 15th October 2012, DOI: 10.1039/c2ra22200k.