ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРОФЛОРЫ СУБСТРАТА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОГАЗА

В мировой практике накоплен достаточный опыт использования возобновляемых источников энергии, в том числе энергии биомассы. Одним из наиболее перспективных видов топлива является биогаз, интерес к использованию которого в последние годы не только не убывает, но и продолжает возрастать. Под биогазом понимают смесь метансодержащих газов, которые образуются при анаэробном разложении органической биомассы. Важным вопросом в получении биогаза является исследование микрофлоры биомассы (субстрата) из которого его получают [1, с. 37].

Цель данного исследования – идентификация микрофлоры боенских отходов, входящих в состав субстрата, используемого для получения биогаза биогазовой станции «Лучки» (Прохоровский район Белгородской области).

Методы исследования

В качестве органической биомассы для опыта были использованы боенские отходы.

Для определения родовой принадлежности применяли следующие методы.

1. Оксидазный тест. Оксидазную активность определяли путем нанесения культуры штамма на диск готовой бумажной индикаторной системы, пропитанной соответствующими реактивами. В случае присутствия цитохромоксидазы должно быть синее окрашивание, в отсутствие – окрашивание отсутствует.

2. Культивирование на дифференциальной среде Олькеницкого (3-х сахарный агар). Колонии штаммов снимали бактериологической петлей и засевали штрихом по косяку и уколом в столбик комбинированной среды для первичной идентификации. В среду добавляется индикатор феноловый красный. Инкубацию проводили в течение 24 часов при t 37° [3, с. 63].

3. Культивирование на дифференциальной среде Симмонса и Ацетатном агаре. Производили посев исследуемых и референс-штаммов на 2 дифференциальные среды: цитратный агар Симмонса и ацетатный агар. В качестве референтных(эталоных) штаммов использовались: Enterobacter aerogenes Citrobacterter freundii   24, Escherichia coli 156. В среды добавляется индикатор бромтимоловый синий. Цвет среды при нейтральном значении рН синий. Культуры засевали бактериологической петлей, нанося материал на скошенную поверхность, инкубируя при температуре (37±1) ºС в течение 24 часов. Наличие роста культуры и изменение цвета среды из зеленого в синий указывает на способность микроорганизма утилизировать цитрат и ацетат натрия (положительная реакция). При отрицательной реакции отсутствует рост культуры и изменение цвета среды [3, с.64].

4. Культивирование на среде Эндо и Кода. Производили посев исследуемых штаммов на среды Эндо и Кода в чашка Петри, инкубировалипри температуре 37 ºС в течение 24 часов [3, с. 58-59].

5. Метод окраски по Граму[3, с.22].

Для определения видовой принадлежности применяли следующие методы.

1. Метод определения каталазной активности. Для этого на предметное стекло наносили перекись водорода и туда же петлю исследуемого микроорганизма. В присутствии каталазы образуются пузырьки водорода.

2. Реакция Фогеса-Проскауэра.α-нафтола и едкого калия.

3. Индол тест. Для определения образования индола в результате утилизации триптофана бактериями, обладающими триптофаназной активностью. Положительная реакция дает розовый и красный цвета.

4. Определение редукции нитратов в нитритов с помощью реактива Грисса по 0,1 мл в каждой пробирке.Появление красного окрашивания свидетельствует о редукции нитратов до нитритов – реакция положительная. При отсутствии окрашивания в пробирку добавляют порошок металлического цинка. Появление красного цвета после добавления цинка свидетельствует об отсутствии редукции нитратов (отрицательный тест). Отсутствие окраски после добавления цинка свидетельствует о редукции нитратов до образования азота. При этом должны быть видны пузырьки газа в “поплавке” (положительный нитратный тест) [2, с. 64-65].

5. Разжижение желатина. Под влиянием фермента желатиназы, продуцируемой некоторыми организмами, входящих в состав среды желатин гидролизуется и утрачивает свойства геля. Этот тест используют для дифференциации членов семейства Enterobacteriaceae, а также неферментирующих грамотрицательных бактерий и анаэробов. При положительном результате среда остается жидкой после ее охлаждения. При отрицательном результате среда уплотняется при охлаждении (то же происходит и в контрольной пробирке) [2, с.62].

6. Гидролиз казеина. Учитывался на молочном агаре. При положительной реакции вокруг штамма наблюдается зона гидролиза.

7. Ферментация углеводов («пестрый ряд»). Специфические углеводы добавляют к основной среде Гисса, содержащей феноловый красный или индикатор Андреде, который изменяет цвет среды под действием кислоты, образующейся при ферментации углевода. При положительной реакции с индикатором феноловым красным среда окрашивается в желтый цвет за счет образования кислоты; при отрицательнойреакции среда защелачивается и остается красно-розового цвета. При положительной реакции с индикатором Андреде среда окрашивается в красно-розовый цвет; при отрицательной реакции цвет среды варьирует от желтого до бесцветного [2, с.61].

Результаты исследования

Для исследования микрофлоры субстрата производили посевы на чашки Петри, используя питательные среды Эндо и МПА. Далее выделили 7 штаммов: І, ІІ, ІІІ, ІІІ′ (как схожие) и ІV, V, VІ с помощью ЕНТЕРОТЕСТ 24. Затем пересеяли все штаммы в отдельные пробирки на скошенный агар для выведения в чистую культуру. Методом окраски по Грамму штаммы условно разделили на две группы: грамотрицательные (І, ІІІ, ІІІ′) и грамположительные (ІІ ІV, V VІ). Для идентификации первой группы были использованы методы определения родовой принадлежности:

Установили родовую принадлежность штаммов первой группы І, ІІІ, ІІІ′ с помощью вышеперечисленных методов:

• Грамотрицательные палочки;
• Оксидазонегативные;
• На среде Олькеницкого – малиново-желтое окрашивание (м/о разлагающие глюкозу до кислоты) (Рис. 1);

Рисунок 1. Рост исследуемых штаммов на среде Олькеницкого

• Плохой рост на среде Симмонса и хороший на ацетатном агаре (Таблица 1).

Таблица 1.

Ростовые характеристики референс-штаммов и исследуемых культур через 24 ч при 35-37°С

На основании этого теста исследуемые штаммы были отненесены к роду Escherichia. Справедливость этого заключения была подтвержена при посеве штаммов на среду Эндо. На дифференциально-диагностической среде Эндо, содержащей лактозу, штаммы формировали окрашенные темно-малиновые с металлическим блеском. При росте штаммов на дифференциально – диагностической среде Кода также был обнаружен характерный для эшерихий рост – пожелтение среды.

Таким образом, на этом этапе удалось установить, что все 3 штамма относятся к роду Escherichia.

Установили видовую принадлежность штаммов І, ІІІ, ІІІ′ Результаты представлены в Таблице 2.

Таблица 2.

Физиолого-биохимическая характеристика исследуемых культур штаммов 1 группы

Родовую принадлежность штаммов ІІ, ІV, V, VІ к роду Bacillus установили при определении морфологических и тинкториальных свойств (Метод окраски по Граму) - грамположительные крупные палочки, образующие споры с центральным расположением. Видовую идентификацию по физиолого-биохимическим характеристикам осуществляли с использованием вышеназванных методов. Результаты представлены в Таблице 3.

Таблица 3.

Видовая идентификация микроорганизмовсемейства Bacillus по физиолого-биохимическим признакам

Таким образом, в ходе проведенного исследования были идентифицированы бактерии по физиолого-биохимическим свойствам следующим образом: І, ІІІ, ІІІ′ штаммы –Escherichia сoli, ІІ –Bacillus cereus, ІV, V – Bacillus subtilis, VІ – Bacillus licheniformis.

Список литературы:

1. Благутина В.В. Биоресурсы // Химия и жизнь – 2007. - №1. – С. 36-39
2. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. Изд. 4-е, перераб. и доп. – М.: Медицина, 1978. - 394 с.
3. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. – М.: Медицина. - 1982. – С. 168.
4. Определитель бактерий Берджи /Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Смита и др. – М.: Мир, 1997. – В 2 томах. – 800 с.