ПОДГОТОВКА И ПРОВЕДЕНИЕ ПОЛИЭТИЛЕНИМИН-ОПОСРЕДОВАННОЙ ТРАНСФЕКЦИИ КЛЕТОК HEK-293T

PREPARATION AND PERFORMANCE OF POLYETHYLENIMINE-MEDIATED TRANSFECTION OF HEK-293T CELLS

Bogomya Roman

Student, Department of Biology, Belarusian State Medical University,

Belarus, Minsk

Sychik Lyudmila

Scientific supervisor, candidate of Sciences in Medicine, associate professor, Belarusian State Medical University,

Belarus, Minsk

АННОТАЦИЯ

В работе освещены ключевые аспекты подготовки к постановке трансфекции клеточной линии HEK-293T с использованием полиэтиленимина для обеспечения экспрессии целевого белка при минимальной цитотоксичности. В результате проведенной трансфекции плазмиды были доставлены в клетку и далее по наблюдаемой флуоресценции зафиксирована экспрессия целевого продукта.

ABSTRACT

The work highlights the key aspects of preparing for the transfection of the HEK-293T cell line using polyethylenimine to ensure the expression of the target protein with minimal cytotoxicity. As a result of the transfection, the plasmids were delivered to the cell, and the expression of the target product was observed through fluorescence.

Ключевые слова: трансфекция; полиэтиленимин; биотехнология.

Keywords: transfection; polyethyleneimine; biotechnology.

В последние десятилетия методика трансфекции широко применяется в различных отраслях биотехнологии с целью получения рекомбинантных белков. Постановка трансфекции не требует сложных манипуляций при её проведении, а также является экономически выгодным методом получения целевого продукта по сравнению с липофекцией и вирусной трансдукцией.

Целью данной работы являлось проведение испытания варианта трансфекции с применением полиэтиленимина (ПЭИ) на клеточной линии HEK-293T (англ. Human Embryonic Kidney 293) в рамках производства ветеринарного ИФА-набора.

Клетки HEK-293T широко используются в биотехнологии благодаря легкости в культивировании, также они экспрессируют T-антиген SV40 –промотор запуска транскрипции целевого белка. Такая модификация клеточной линии позволяет плазмидам с промотором SV40 эффективно реплицироваться в клетках, что, в свою очередь, обеспечивает необходимый уровень транскрипции и как следствие высокий выход целевого продукта [2]. В качестве вектора для экспрессии использовались плазмиды pTurbo-GFP-N, содержащие промотор SV40, а также ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок GFP (англ. green fluorescent protein).

Важным аспектом в проведении трансфекции является выбор химического носителя ДНК, встраиваемой в геном клетки. В данной работе использовался полиэтиленимин. Также в качестве переносчика ДНК в эукариотическую клетку возможно использование полисахарида хитозана, карнитина, гомополимеров аминокислот и иных положительно заряженных полимеров. Указанные полимерные молекулы обладают свойством образовывать комплексы с ДНК путем взаимодействия с отрицательно заряженными остатками фосфорной кислоты в её составе . Такой комплекс поступает в клетку путем эндоцитоза. ДНК, связанная с катионным полимером, защищена от разрушительного воздействия внутриклеточных нуклеаз (рис. 1).

Рисунок 1. Сборка и транспортировка комплекса ДНК-ПЭИ

Исходя из литературных источников, для качественного протекания трансфекции необходимо учитывать ряд условий. Клетки после посева должны достигнуть 70%-ной конфлюентности. От клеточной плотности зависит количество плазмидной ДНК, которое будет содержаться в смеси для трансфекции: на 1 млн клеток ­– 1 мкг плазмидной ДНК. Объем трансфецирующей смеси должен составлять 1/10 от общего объема среды в используемой культуральной посуде (лунка планшета, чашка Петри, культуральный флакон) [3].

Следующим важным условием является подбор оптимального соотношения ДНК–ПЭИ. Для обеспечения положительного заряда комплекса необходимо использовать соотношения, при которых ПЭИ будет в избытке, например, 1:2, 1:5, 1:10 и т.д. Выбор соотношения зависит от молекулярной массы ПЭИ. В данной работе использовался ПЭИ с молекулярной массой 20 кДа, а соотношение ДНК–ПЭИ составило 1:2 [1].

При работе с ПЭИ также необходимо учитывать условия его хранения. Следует избегать многократных размораживаний и замораживаний. Хранение при температуре +4°С допускается в течении месяца. Замораживание при температуре -20°С допускает хранение до одного года [2, 3]. Соблюдение описанных правил обеспечивает максимальную эффективность трансфекции при минимальной цитотоксичности.

В соответствии с указанными выше условиями, была проведена трансфекция клеток HEK-293T в трех повторах с использованием двух плазмид, имеющих внутренние лабораторные номера pTurbo 493 и pTurbo 700. Плазмиды имели разные вставки интересующих последовательностей ДНК. В качестве контроля выступали лунки с клетками HEK-293T, не подвергшиеся трансфекции. В первый день производился посев клеток НЕК-293Т в 12-луночные планшеты по 300 тыс. клеток на лунку. Для культивирования использовалась полная среда DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) с 10%-ным содержанием эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиком (1500 мкл на лунку).

На второй-третий день при достижении клетками конфлюентности 70-80% (около 500.000 клеток) из лунок удаляли среду и добавляли 1350 мкл пустой среды DMEM. По каплям добавляли в лунки по 150 мкл трансфецирующей смеси (1/10 от целого объема среды в лунке). Через 4 часа заменяли пустую среду на среду с антибиотиком, но без сыворотки, так как присутствие посторонних белков и гормонов может препятствовать трансфекции. Инкубировали клетки в течение 48 часов при 38°C, 5% CO₂. По истечении 48 часов производилась детекция результатов (рис. 2).

Трансфецированные клетки начинали продуцировать GFP, по уровню флуоресценции которого возможно установить качество проведенной трансфекции. Для анализа флуоресценции использовался спектрофотометр Tecan Infinite 200 PRO. Исследование было проведено в лаборатории негосударственного учреждения.

Рисунок 2. Результаты трансфекции

Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что трансфекция прошла успешно, и полиэтиленимин явился эффективным трансфецирующим агентом. Методика является доступной и подходящей для получения рекомбинантных белков с минимальной цитотоксичностью.

В дальнейшем необходимо провести ряд сравнительных испытаний с вариациями условий и параметров и более детальным подсчетом жизнеспособности клеток для получения большего объема данных и оптимизации процесса разработки ветеринарного ИФА-набора.

Список литературы:

1. Шинкевич В.А. Эффективность трансфекции клеток in vitro с различными изоформами полиэтиленимина / В.А. Шинкевич, М.В. Стёганцева, А.Н. Мелешко // Молодежь в науке-2017: сб. мат. Междунар. конф. молодых ученых: в 2 книгах. Том Ч. 2. Национальная академия наук Беларуси, Совет молодых ученых. – 2018. – С. 103-113.
2. ATCC. Primary Cell Culture Guide. – Manassas V.A.: American Type Culture Collection, 2022. – 30 p.
3. Gibco. Cell Culture Basics Handbook. – Carlsbad C.A.: Thermo Fisher Scientific, 2021. – 132 p.