ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММА МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ PICHIA PASTORIS GS115,

ПРОДУЦИРУЮЩЕГО РЕКОМБИНАНТНУЮ β-ГАЛАКТОЗИДАЗУ

Асраркулова Анжелла Саидкаримовна

магистрант 2 курса, кафедра физиологии и биофизики НУУз, г. Ташкент

Е-mail: angeline_backsed@mail.ru

Азимова Шахноза Садыковна

научный руководитель, доктор биологических наук, зав. лаб. молекулярной генетики ИХРВ АН РУз, г. Ташкент

Левицкая Юлия Владимировна

научный руководитель, кандидат биологических наук, доцент НУУз,

г. Ташкент

С целью получения рекомбинантных ферментных препаратов используется дрожжевая система экспрессии, в частности дрожжи P.pastoris [6, с. 169]. Являясь эукариотическим организмом, P.pastoris имеет ряд преимуществ среди высших эукариотических систем экспрессии. К ним относятся процессинг и фолдинг белков, а также посттрансляционные модификации [8, с. 118].

В ходе получения нового штамма дрожжей используются молекулярные маркеры. Одним из таких маркеров является фермент β-галактозидаза [3, c. 601]. Данный фермент относится к классу гидролаз, отщепляющих концевой нередуцированный остаток β-D-галактозы в β-галактозидах с образованием свободных моносахаридов, либо переносящих остаток β-D-галактозы на молекулу лактозы с образованием галактоолигосахаридов [1, c. 52].

Целью работы являлось получение нового штамма метилотрофных дрожжей GS115 с использованием гена β-галактозидазы, как маркера экспрессии генов.

Материалы и методы. В работе были использованы бактериальный штамм E.coli TOP10F’, содержащий в себе плазмиду pPIC3.5/lacZ, и коммерческий штамм дрожжей P.pastoris GS115 (Invitrogen). Векторная конструкция pPIC3.5/lacZ была получена сотрудниками лаборатории молекулярной генетики ИХРВ АН РУз Сасмаковым С.А., Махневым А.А.

С целью трансформации дрожжевого штамма GS115 вектор pPIC3.5/lacZ выделяли из бактериального штамма методом щелочного лизиса [7, c. 55]. Для этого клетки E.coli инкубировали в жидкой LB среде (1% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl, pH 7.0, ампициллин 100 мкг/мл) на орбитальном шейкере 14-16 ч., +37^оС, 180 об/мин. Полученный осадок клеток последовательно обрабатывали: раствором I (50 мМ глюкоза, 25 мМ трис-HCl, pH 8.0, 10 мМ ЭДТА),  раствором II (0.2Н NaOH, 1% SDS) и раствором III (5М ацетат калия pH 5.0). Далее разрушенные клетки центрифугировали, а в полученный супернатант добавляли 2.5V 96% этилового спирта. После осаждения пДНК в спирте, пробу вновь центрифугировали при 4500 rpm 30 мин +4^оС, а осадок промывали 70% спиртом. Осадок высушили и растворили в TE буфере (10мМ трис-HCl рН 8.0, 1мМ ЭДТА).

Очистку пДНК проводили методом электроэлюирования в ванночку [2, c. 171]. Полученные образцы осаждали в 2.5V 96% этилового спирта по вышеописанной методике. Концентрацию очищенной пДНК определяли на спектрофотометре GeneQuant II, которая составила 1 мкг/мкл.

Трансформацию дрожжевых клеток проводили методом электропорации [6, c. 176]. В работе использовался штамм GS115 Pichia pastoris, который имеет мутацию в гене гистидинол дегидрогеназа (his4). С целью получения электрокомпетентных дрожжевых клеток производили посев штамма GS115 на твердую YPD среду (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 2% глюкоза, 2% агар-агар). Затем вырастили 5 мл культуры клеток дрожжей в жидкой YPD среде (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 2% глюкоза) при 30°C в течение ночи. Далее инокулировали свежую YPD среду в объеме 500 мл 0,1-0,5 мл полученной суспензией клеток и инкубировали по достижении значений OD₆₀₀ = 1.3–1.5. Полученную культуру клеток осаждали и последовательно промывали в ледяной стерил. воде и 1 М сорбитоле, сокращая объем суспензии клеток. Конечный объем суспензии составил 1.5 мл [5, c. 77].

Непосредственно перед трансформацией проводили линеаризацию пДНК по сайту рестрикции SalI (рис. 1) [5, c. 34]. Для данной реакции использовали 1 мкг пДНК и 1 ед. рестриктазы SalI. Реакцию проводили при 37^оС. Процесс контролировали нанесением образца в агарозный гель. Данную процедуру выполняли до тех пор, пока вся пДНК не расщепилась. Реакцию останавливали добавлением 0.5 М ЭДТА (рН 7.5). пДНК эксрагировали смесью фенол-хлорофрм-изоамиловый спирт (25:24:1) и далее осаждали в 96% этиловом спирте. Осадок пДНК ресуспендировали в ТЕ буфере [2, c. 116].

Для трансформации 80 мкл суспензии электрокомпетентных клеток и линеаризованную  пДНК в объемах 2, 3 и 5 мкл с концентрацией 1мкг/мкл переносили в ледяные 0.2 см кюветы для электропорации. Инкубировали кюветы на льду 5 минут и далее вносили их в Eppendorf Electroporator 2510. Электрический импульс подавали в течение 6 мс при  1500 В. После этого в смесь добавляли 1 мл ледяного 1 М сорбитола и переносили содержимое кюветы в стерильные микроцентрифужные пробирки. На селективные среды RDB (1 M сорбитол, 2% глюкоза, 1.34% YNB, 4 × 10^-5% биотин, 0.005% аминокислоты, 2% агар) переносили по 200 мкл каждой пробы и инкубировали при 30°C. Селекцию трансформантов проводили по способности расти на среде без добавления гистидина, т.к. клонируемый вектор несет в себе ген HIS4. Контролем служила среда RDBH с добавлением гистидина (0.004%). Одиночные колонии на опытных и контрольных средах появлялись на 5 день после трансформации.

Для оценки уровня экспрессии рекомбинантного белка трансформанты культивировали при 30°C на орбитальном шейкере Incubator ES-20 по достижении OD₆₀₀=2-6. Из полученных культур клеток готовили клеточные лизаты дрожжей. Клетки осаждали центрифугированием, а затем отмывали от среды с помощью Breaking buffer (7.8 г/л NaH₂PO₄ · 2H₂O; 0.372 г/л ЭДТА; 50 мл/л глицерол) с добавлением PMSF (0.087г/мл). Отмытые клетки ресуспендировали в том же растворе до ОD₆₀₀=200. Клетки лизировали методом стеклянных шариков (Sigma, 0,2µm) [5, c. 61].

Полученные лизаты клеток проверяли на β-галактозидазную активность по реакции гидролиза о-нитрофенил-β-D-галактопиранозида (ONPG) β-галактозидазой в Z-буфере (60 мМ Na₂HPO₄·7H₂O, 40 мМ NaH₂PO₄·H₂O, 10 мМ KCl, 1 мМ MgSO₄·7H₂O, 50 мМ β-меркаптоэтанол), при pH 7.0 и температуре 28^оС. Реакцию завершили путем добавления 1 М Na₂CO₃. Продукт реакции, о-нитрофенол, определяли спектрофотометрически при λ=420 нм на спектрофотометре Specol 1300 UV, Analitic Jena [9, c. 344]. По данным зарубежных авторов активность очищенного фермента β-галактозидазы составляет 300000 единиц/мг белка [5, c. 91].

Результаты и их обсуждение.

В результате проведенных исследований были получены три культуры клеток P.pastoris (таб. 1). Эффективность трансформации определяли по формуле [4, с. 335]:

[2]

Таблица 1.

Данные по расчету эффективности трансформации.

По данным расчётов установлено, что наиболее эффективной является трансформация с концентрацией пДНК 0,9 мкг. Эффективность при этом составила 277 трансформантов/мкг плазмидной ДНК.

Уровень экспрессии рекомбинантного белка определяли по реакции гидролиза субстрата ONPG β-галактозидазой. С этой целью использовались клоны, трансформированные пДНК в концентрации  0,9 мкг. Среднее значение активности фермента β-галактозидазы составило 133300 ед/мг белка. 

Таким образом, в ходе проведенных исследований был получен новый штамм метилотрофных дрожжей P.pastoris GS115, экспрессирующий рекомбинантную β-галактозидазу. Оптимальными условиями проведения трансформации оказались: концентрация пДНК 0,9 мкг, время прохождения электрического импульса 6 мс при 1500 В. Активность рекомбинантной β-галактозидазы составила 133300 ед/мг белка. Последующие этапы работ будут связаны с экспрессией других белков.

Список литературы:

1. Костеневич А.А., Сапунова Л.И. Бактериальные β-галактозидазы: биохимическое и генетическое разнообразие / Труды БГУ Обзоры. – 2013. - Том 8. Часть 1. - С. 52-63;
2. Маниатис Т. и др. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. / Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. – М.: Мир. - 1984, - 480 с., ил;
3. Carla O. Recombinant microbial systems for improved β-galactosidase production and biotechnological applications / Carla O., Pedro M.R., Lucília D. //  Biotechnology Advances. – 2011. №29. - P. 600–609;
4. Frank H. S. Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory / Academic Press. – 2010. Second Edition. – P. 335-336;
5. Invitrogen Pichia Expression Kit. For expression of recombinant proteins in Pichia pastoris: user guide / Life Technologies Corp. – 2014;
6. James M. C. Expression in the Yeast Pichia pastoris / James M. Cregg, Ilya T., Anasua K., Jay S., Knut M., Thomas Ch. // Methods in Enzymology. – 2009. Vol. 463. - P. 169-189;
7. Joseph S., David W. R. Molecular Cloning: a laboratory manual / Cold Spring Harbor Laboratory Press. – 2001. Third Edition. – P. 55-65;
8. Pingzuo Li et. al. Expression of Recombinant Proteins in Pichia Pastoris / Applied Biochemistry and Biotechnology. – 2007. № 142. – P. 105–124;
9. Rezaee A. et. al. A rapid and sensitive assay of β-galactosidase in yeast cells / Anals of Microbiology. – 2003. Vol. 53 №3. - P. 343–347.