ВЛИЯНИЕ  ГИПОТЕРМИИ  НА  СОДЕРЖАНИЕ  ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИХ  ПИГМЕНТОВ  В  ФОТОМИКСОТРОФНОМ  КАЛЛУСЕ  ПАЖИТНИКА  ГРЕЧЕСКОГО  В  УСЛОВИЯХ  ДЕФИЦИТА  ЭКЗОГЕННОЙ  САХАРОЗЫ

Боневич  Елена  Васильевна

студент  4  курса,  биологический  факультет  БГУ,  Республика  Беларусь,  г.  Минск

E -mail:  alenabonevich123@gmail.com

Логвина  Анна  Олеговна

научный  руководитель,  ассистент  кафедры  клеточной  биологии  и  биоинженерии  растений  БГУ,  Республика  Беларусь,  г.  Минск

Введение

Пажитник  греческий  (Trigonella  foenum-graecum  L.)  —  известное  лекарственное  растение,  которое  широко  применяется  во  многих  странах  в  лечении  и  профилактике  целого  ряда  заболеваний.  Пажитник  является  богатым  источником  многих  биологически  активных  веществ  [5,  с.  260—262].  Применение  биотехнологического  метода  культуры  клеток  и  тканей  растений  является  альтернативным  способом  получения  растительного  сырья  пажитника  богатого  ценными  вторичными  метаболитами  [3].

Предыдущими  исследованиями  было  показано,  что  исходно  гетеротрофная  каллусная  культура  пажитника  греческого,  культивируемая  в  присутствии  4  сахарозы,  в  условиях  света  накапливала  фотосинтетические  пигменты,  что  обуславливало  ее  зеленую  окраску  [1].  Образование  данных  соединений  в  клетках  свидетельствует  о  формировании  хлоропластов  и  становлении  фотосинтетического  аппарата.  По  завершению  данного  процесса  ткани  могут  приобрести  способность  к  фотосинтетическому  усвоению  углерода,  то  есть  осуществлять  характерный  для  интактного  растения  фотоавтотрофный  способ  питания.  Использование  таких  клеточных  культур  с  целью  получения  ценных  лекарственных  субстанций  представляется  весьма  перспективным,  поскольку  для  их  выращивания  применяются  дорогостоящие  органические  соединения,  необходимые  для  поддержания  активного  роста,  такие  как  углеводы,  аминокислоты,  витамины.  Переход  культуры  клеток  с  гетеротрофного  на  фотоавтотрофный  способ  питания  может  существенно  снизить  затраты  на  ее  выращивание  и  привести  к  стимуляции  накопления  вторичных  метаболитов,  синтез  многих  групп  которых  осуществляется  в  хлоропластах  или  при  их  активном  участии.  Таким  образом,  получение  фотоавтотрофной  линии  пажитника  греческого  представляет  значительный  практический  интерес. 

Для  получения  фотоавтотрофных  линий  применяют  клеточную  селекцию  путем  отбора  наиболее  зеленых  участков  ткани  и  проводят  их  культивирование  на  средах  с  низким  содержанием  углеводов  или  полным  их  отсутствием  с  целью  стимуляции  фотосинтетической  активности.  Однако  получить  линию  клеток,  осуществляющую  питание  исключительно  за  счет  углерода  воздуха  чрезвычайно  сложно.  Известно,  что  действие  стрессоров  в  малой  дозе  часто  оказывает  положительный  эффект  на  физиолого-биохимические  показатели  растительных  объектов,  в  том  числе  на  содержание  хлорофиллов  и  каротиноидов.  Не  является  исключением  и  действие  гипотермии.  В  связи  с  чем,  можно  полагать,  что  кратковременное  действие  низкими  положительными  температурами  в  комбинации  со  снижением  уровня  сахарозы  в  среде  может  привести  к  повышению  уровня  фотосинтетических  пигментов,  свидетельствующего  о  росте  фотосинтетической  активности  в  культуре  клеток  пажитника  греческого.

В  этой  связи  целью  данной  работы  было  изучить  влияние  гипотермии  на  содержание  фотосинтетических  пигментов  в  фотомиксотрофной  каллусной  культуре  пажитника  греческого  при  низких  концентрациях  и  исключении  экзогенной  сахарозы.

Материалы  и  методы  исследований

Объектом  изучения  служил  фотомиксотрофный  стеблевой  каллус  пажитника  греческого  ярового  сорта  Ovari  4,  полученный  на  базе  кафедры  физиологии  и  биохимии  растений  Белорусского  государственного  университета  в  ноябре  2009  г.

Культивирование  каллуса  осуществляли  на  питательной  среде  Мурасиге  и  Скуга  (МС)  [6].  Среду  МС  дополняли  регуляторами  роста  2,4-дихлорфеноксиуксусной  кислотой  (2,4-Д),  кинетином  и  индолил-3-уксусной  кислотой  (ИУК)  в  концентрациях  1,0  мг/л,  2,0  мг/л  и  2,0  мг/л  соответственно.  Каллусная  культура  выращивалась  на  свету  в  условиях  фитостата  (14  ч  свет/10  ч  темнота)  при  комнатной  температуре  и  интенсивности  освещения  3000  лк. 

Содержание  сахарозы  в  опытных  вариантах  питательных  сред  составляло  0,  0,5,  1  %.  Также  тестированию  подвергалась  среда  с  нормальным  содержанием  сахарозы,  равным  4  %,  применяем  для  поддержания  исследуемой  каллусной  ткани.  Каллус,  выращиваемый  в  присутствии  различных  концентраций  сахарозы,  подвергался  24-часовому  воздействию  гипотермии  (6°C),  на  6-е  и  на  20-е  сутки  культивирования,  что  соответствует  латентной  и  логарифмической  фазам  роста  каллусной  культуры.  Контрольными  были  нормальные  температурные  условия  культивирования  каллуса  при  различной  обеспеченности  сахарозой.

Количественное  определение  фотосинтетических  пигментов  проводили  по  Мокроносову  [2,  с.  183].

Для  обработки  полученных  результатов  были  использованы  стандартные  методы  вариационной  статистики.  Основными  статистическими  характеристиками  служили:  средняя  арифметическая  величина,  среднее  квадратичное  отклонение  и  ошибка  средней  величины  [4,  с.  312].  Данные  величины  рассчитывали  с  помощью  пакета  статистического  анализа  данных  программы  Microsoft  Excel.  На  диаграммах  приведены  средние  величины  ±  ошибка  средней  величины. 

Результаты  и  обсуждение

На  рисунке  1  представлены  результаты,  демонстрирующие  влияние  низкотемпературного  воздействия  на  содержание  хлорофилла  a  в  исследуемой  ткани.

Показано,  что  после  обработки  культуры  холодом  на  6-е  сутки,  то  есть  во  время  латентной  фазы  роста,  выращиваемой  на  средах  с  концентрацией  сахарозы  0,5  %  и  ее  полным  исключением,  содержание  хлорофилла  a  существенно  не  изменялось.  В  то  время  как  в  вариантах  опыта,  где  уровень  сахарозы  составлял  1  %  и  4  %,  наблюдалось  увеличение  содержания  указанного  пигмента.  После  воздействия  холодом  на  20-е  сутки  культивирования  не  происходило  значительных  изменений  в  активности  накопления  хлорофилла  a  в  каллусе,  культивируемом  на  питательных  средах  без  внесения  сахарозы  и  с  ее  1  и  4  %-ным  содержанием.  Каллус,  выращиваемый  в  присутствии  0,5  %  сахарозы,  на  кратковременное  действие  холода,  оказанное  во  время  логарифмической  фазы  роста,  отреагировал  повышением  интенсивности  синтеза  указанного  пигмента.

Рисунок  1.  Действие  гипотермии  на  содержание  хлорофилла  a   в  каллусной  культуре  пажитника  греческого  при  варьировании  содержания  экзогенной  сахарозы

Также  изучалось  влияние  гипотермии  на  содержание  хлорофилла  b  в  каллусной  культуре  пажитника  греческого  (рисунок  2).  Отмечается  заметное  увеличение  содержания  данного  пигмента  в  исследуемом  объекте  после  односуточного  действия  низкой  положительной  температурой  во  время  латентной  фазы,  особенно  выраженное  при  культивировании  каллуса  на  среде,  включающей  1  %  сахарозы.  При  односуточной  экспозиции  в  условиях  гипотермии  ткани,  находящейся  на  логарифмической  стадии  роста,  наблюдается  иная  тенденция  —  содержание  хлорофилла  b  либо  понижается,  как  на  среде  без  сахарозы  и  с  ее  0,5  %-ным  содержанием,  либо  же  не  меняется  относительно  контрольного  уровня,  как  в  вариантах  среды  с  1  и  4  %  углевода.

Рисунок  2.  Действие  гипотермии  на  содержание  хлорофилла  b   в  каллусной  культуре  пажитника  греческого  при  варьировании  содержания  экзогенной  сахарозы

Гипотермия  отразилась  и  на  содержании  каротиноидов  в  исследуемой  каллусной  ткани.  Так,  было  показано  повышение  их  уровня  после  низкотемпературного  воздействия  во  время  латентной  и  логарифмической  фаз  цикла  выращивания  (рисунок  3).  Важно  отметить,  что  при  действии  холодом  во  время  логарифмической  стадии  роста  стимуляция  синтеза  каротиноидов  в  культуре  является  более  значительной,  особенно  на  среде  с  содержанием  сахарозы  0,5  %.

Рисунок  3.  Действие  гипотермии  на  содержание  каротиноидов  в  каллусной  культуре  пажитника  греческого  при  варьировании  содержания  экзогенной  сахарозы

Также  было  изучено  влияние  гипотермии  на  сумму  хлорофиллов  a  и  b,  и  отношение  суммы  хлорофиллов  к  содержанию  каротиноидов.

Рисунок  4.  Действие  гипотермии  на  суммарное  содержание  хлорофиллов  в  каллусной  культуре  пажитника  греческого  при  варьировании  содержания  экзогенной  сахарозы

Наиболее  высокое  суммарное  содержание  хлорофиллов  обнаруживается  в  каллусе,  выращенном  в  присутствии  1  %  сахарозы  и  подвергнутом  холодовому  стрессу  во  время  латентной  фазы  ростового  цикла  (рисунок  4).  В  данном  варианте  уровень  хлорофиллов  выше,  чем  на  среде,  дополненной  4  %  сахарозы.

Что  касается  отношения  суммы  хлорофиллов  к  содержанию  каротиноидов,  то  холод,  как  видно  из  рисунка  5,  оказал  негативное  влияние  на  данный  показатель  каллуса,  при  его  культивировании  в  условиях  недостатка  сахарозы,  за  исключением  варианта  среды  с  1  %  содержанием  углевода,  когда  низкотемпературное  воздействие  привело  к  значительному  повышению  указанного  соотношения.

Рисунок  5.  Действие  гипотермии  на  отношение  суммарного  содержания  хлорофиллов  к  уровню  каротиноидов  в  каллусной  культуре  пажитника  греческого  при  варьировании  содержания  экзогенной  сахарозы

На  среде  с  нормальным  содержанием  сахарозы,  составляющим  4  %,  изменения  в  отношении  суммы  хлорофиллов  к  уровню  каротиноидов  в  клеточной  линии  после  действия  гипотермии  были  выражены  мало.

Выводы

Приведенные  данные  указывают  на  то,  что  понижение  концентрации  экзогенной  сахарозы  приводит  к  повышению  чувствительности  фотосинтетического  аппарата  клеток  каллусной  культуры  пажитника  греческого  к  кратковременному  действию  низкими  положительными  температурами,  проявляющегося  в  изменении  содержания  фотосинтетических  пигментов.  Гипотермия  оказывает  стимулирующее  действие  на  накопление  хлорофиллов,  что  позволяет  судить  о  возможности  применения  данного  подхода  для  стимуляции  фотосинтетической  активности  в  каллусной  ткани,  культивируемой  в  условиях  дефицита  источника  углерода.  Наиболее  значительный  положительный  эффект  на  уровень  накопления  фотосинтетических  пигментов  в  фотомиксотрофном  каллусе  пажитника  греческого  достигается  при  односуточном  действии  холодом  во  время  латентной  фазы  (6-е  сутки)  ростового  цикла  культуры  и  при  ее  выращивании  на  питательной  среде  с  1  %-ным  содержанием  сахарозы. 

Список  литературы:

1.Логвина  А.О.,  Юрин  В.М.  Получение  фотомиксотрофных  линий  каллусных  культур  Trigonella  foenum-graecum  //  Сборник  статей  Международной  научной  конференции  "Молекулярные,  мембранные  и  клеточные  основы  функционирования  биосистем",  XI  съезд  Белорусского  общественного  объединения  фотобиологов  и  биофизиков,  17—20  июня  2014  г.,  Минск,  Беларусь.  2014.  —  С.  200—202.

2.Мокроносов  А.Т.  Малый  практикум  по  физиологии  растений.  М.:  Издательство  Московского  университета,  1994.  —  C.  183.

3.Плечищик  Е.Д.  Пажитник  греческий  (Trigonella  foenum-graecum  L.)  как  источник  широкого  спектра  биологически  активных  соединений  //  Труды  БГУ.  Минск.  —  2009.  —  Т.  4,  —  Ч.  2.  —  С.  138—146.

4.Рокицкий  П.Ф.  Биологическая  статистика.  М.:  Высш.  шк.,  1978.  —  C.  312.

5.Barnes  J.,  Anderson  L.A.,  Philipson  J.D.  Herbal  medicines  (3rd  ed).  London:  Pharmaceutical  Press,  2007.  —  710  p.

6.Murashige  T.,  Skoog  F.  A  revised  medium  for  rapid  growth  and  bioassays  with  tobacco  tissue  cultures  //  Physiol.  Plant.  —  1968.  —  Vol.  15,  —  №  13.  —  P.  473—497.