АНАЛИЗ  ГЕНЕТИЧЕСКИХ  ПРИЧИН  МУЖСКОЙ  ИНФЕРТИЛЬНОСТИ  В  ПРОГРАММАХ  ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ  РЕПРОДУКТИВНЫХ  ТЕХНОЛОГИЙ

Машкин  Анатолий  Игоревич

Филимоненкова  Вероника  Юрьевна

Зыбайло  Виктория  Сергеевна

студенты  5  курса  лечебного  факультета  УО  «Белорусский  государственный  медицинский  университет»,  Республика  Беларусь,  г.  Минск

E-mail: 

Парфенов  Олег  Ильич

врач-интерн  УЗ  «10-я  городская  клиническая  больница  г.  Минска»,  Республика  Беларусь,  г.  Минск

Юшко  Евгений  Иванович

научный  руководитель  канд.  мед.  наук,  доцент  кафедры  урологии  УО  «Белорусский  государственный  медицинский  университет»,  Республика  Беларусь,  г.  Минск

Проблема  бесплодия  является  одной  из  самых  актуальных  проблем  современной  медицины  [3,  5].  Согласно  статистике  Всемирной  организации  здравоохранения  (ВОЗ)  бесплодие  в  супружеских  парах  достигает  15  %  [1,  6].  Беларусь  не  является  исключением.  Частота  бесплодия  в  супружеских  парах  в  нашей  стране  составляет  около  14,5  %  [4].

Из  многочисленных  определений  понятия  «бесплодный  брак»  можно  отметить,  что  бесплодным  считается  брак,  в  котором  по  тем  или  иным  причинам,  происходящим  в  организме  женщины  или  мужчины  либо  обоих  партнеров,  беременность  не  наступает  при  регулярной  половой  жизни  без  применения  противозачаточных  средств  в  течение  12  месяцев  при  условии  детородного  возраста  женщины  [1].  В  мире  отмечена  тенденция  к  росту  мужской  инфертильности,  причины  возникновения  которой  связывают  с  ростом  инфекционно-воспалительных  заболеваний  органов  мочеполовой  системы,  увеличением  числа  врожденных  аномалий  развития  половых  органов,  влиянием  вредных  факторов  окружающей  среды,  урбанизацией,  широким  и  бесконтрольным  применением  лекарственных  средств,  аллергизацией  населения  и  другими  факторами  [12].  В  Республике  Беларусь  частота  бесплодия  по  вине  мужчин  в  бесплодных  браках  достигает  35—40  %,  что,  безусловно,  говорит  о  высокой  социальной  и  медицинской  значимости  проблемы.

Мужское  бесплодие  —  это  болезнь,  обусловленная  нарушением  генеративной  и/или  копулятивной  функции  и  классифицируемая  в  «Международной  классификации  болезней»  (МКБ-10,  Женева  1995)  как  инфертильное  состояние  в  качестве  самостоятельной  нозологической  формы  [9].

Оценка  фертильности  мужчины,  обратившегося  за  помощью  по  поводу  бесплодия,  включает  целый  ряд  исследований,  основным  из  которых  является  анализ  спермограммы,  производимый  дважды  с  интервалом  не  менее  двух  недель  [8,  9].  Результат  данного  исследования  может  быть  оценен  следующим  образом:

·     олигозооспермия:  концентрация  сперматозоидов  менее  20  млн/мл  или  менее  40  млн/эякулят;

·     тератозооспермия:  количество  морфологически  нормальных  форм  сперматозоидов  менее  30  %  при  оценке  морфологии  по  рекомендациям  ВОЗ  или  менее  14  %  при  оценке  по  Крюгеру;

·     астенозооспермия:  подвижность  сперматозоидов  менее  25  %  категории  «а»  или  менее  50  %  категории  «а+в»;

·     олигоастенотератозооспермия:  сочетание  всех  трех  вариантов  патоспермии;

·     азооспермия:  сперматозоиды  в  эякуляте  отсутствуют,  но  могут  встречаться  клетки  сперматогенеза;

·     аспермия:  отсутствие  семяизвержения.

Наше  исследование  посвящено  одной  из  наиболее  тяжелых  и  сложных  для  лечения  патологий  фертильности  мужчин,  такой  как  азооспермия.  Частота  данной  патологии  в  мире  в  конце  прошлого  столетия  составляла  5  %  случаев  от  общего  количества  бесплодных  мужчин  [19],  однако  данные  полученные  в  исследованиях  2005  года  показывают,  что  этот  показатель  вырос  до  10—15  %  [18].

Принято  различать  2  основных  типа  азооспермии:  необструктивную  (секреторное  бесплодие)  и  обструктивную  (экскреторное  бесплодие)  [11].  Необструктивная  азооспермия  связана  с  различными  нарушениями  сперматогенеза,  при  этом  семявыносящие  пути  остаются  проходимыми,  а  в  эякуляте  могут  выявляться  клетки-предшественницы  (сперматоциты,  сперматиды  и  др.).  Как  правило,  факторами,  приводящими  к  необструктивной  азооспермии  являются:  эндокринные  нарушения,  недоразвитие  гениталий,  генетические  нарушения  (микроделеции  AZF  (Azoospermia  Factor,  фактор  азооспермии)  локуса  Y  хромосомы,  мутация  гена  муковисцидоза).

Роль  генетических  факторов  в  процессе  сперматогенеза  и  нормальной  фертильности  мужчин  нельзя  недооценивать.  Впервые  о  роли  генетических  причин  в  нарушениях  сперматогенеза  высказано  L.  Tiepolo  и  O.  Zuffardi  в  1976  г.  [28].  В  своем  исследовании  они  установили,  что  бесплодие  у  мужчин  и  азооспермия  могут  быть  связаны  с  нарушениями  структуры  Y  хромосомы.  Участок  длинного  плеча  Y  хромосомы,  ответственный  за  правильный  сперматогенез,  они  назвали  AZF  локусом.  В  дальнейшем  технологический  прорыв,  внедрение  новых  методов,  таких  как  полимеразная  цепная  реакция  (ПЦР),  электронная  микроскопия,  использование  специфических  генетических  зондов  (последовательности  нуклеиновых  кислот,  меченные  радиоактивными  метками)  позволили  ученым  детально  изучить  эту  область  мужской  половой  хромосомы  и  построить  ее  карту.  Впоследствии  AZF  локус  был  разделен  на  3  субрегиона:  AZFa,  AZFb,  AZFc  [24].  В  каждом  из  субрегионов  обнаружены  специфические  гены,  отвечающие  за  правильность  формирования  и  созревания  сперматозоидов.  Следующим  этапом  стало  определение  степени  значимости  каждого  гена  в  процессе  сперматогенеза  и  определение  клинического  результата  при  их  отсутствии  или  неправильном  функционировании.

Было  установлено,  что  генетические  нарушения  данных  генов  обнаруживаются  в  среднем  у  10—12  %  мужчин  с  азооспермией  и  у  8—9  %  мужчин  с  олигозооспермией  тяжелой  степени  (количество  сперматозоидов  в  эякуляте  менее  5  млн/мл)  [24].  Наиболее  частой  мутацией  являются  выпадения  (микроделеции)  генов  данного  локуса.  По  частоте  встречаемости  среди  всех  микроделеций  первое  место  занимают  микроделеции  AZFc  субрегиона  и  составляют  65—70  %.  Второе  место  занимают  микроделеции  захватывающие  AZFb  и/или  AZFb  и  AZFc  субрегионы  (AZFb  и  AZFb+c).  Наименее  часто  встречается  микроделеция  AZFa  субрегиона  —  5—10  %.  В  редких  случаях  встречаются  комбинации  данных  мутаций,  например,  AZFa+b,  AZFa+b+c  [16].

Однако  врачей  занимающихся  лечением  бесплодия  интересует  в  первую  очередь  вопрос  использования  полученного  при  молекулярно-генетическом  анализе  результата  в  прогностических  целях.  Дальнейшие  клинические  исследования  показали,  что  все  три  субрегиона  Y  хромосомы  имеют  разные  функции  в  процессе  сперматогенеза  и  при  некоторых  видах  микроделеций  существует  возможность  получения  зрелых  сперматозоидов  путем  проведения  биопсии  яичка.  Так,  микроделеции  AZFa  и  AZFb  субрегионов  ассоциированы  с  невозможностью  получения  зрелых  половых  клеток,  тогда  как  у  пациентов  с  утратой  субрегиона  AZFc  примерно  в  71  %  случаев  удается  получить  зрелые  сперматозоиды.

Эти  данные  послужили  огромным  прорывом  в  отборе  кандидатов  для  проведения  биопсии  яичка  с  целью  получения  зрелых  сперматозоидов,  которые  в  последующем  можно  использовать  в  программах  вспомогательных  репродуктивных  технологий  (ВРТ),  в  частности  такого  метода  как  ICSI  (introcytoplazmatic  sperm  injection,  интрацитоплазматическая  инъекция  сперматозоида).

Применение  вспомогательных  репродуктивных  технологий,  и,  в  частности,  такого  метода,  как  ICSI,  позволяет  части  пациентов  с  микроделециями  AZF  локуса  иметь  потомство  [17].  Однако  следует  иметь  в  виду,  что  плоды  мужского  пола  будут  наследовать  Y-микроделеции,  соответственно,  репродуктивным  проблемам  отца  [20,  22].  Пациентам  с  AZF  микроделецией  Y  хромосомы  необходимо  рекомендовать  использование  предимплантационной  диагностики  пола  при  применении  ВРТ  с  целью  переноса  эмбрионов  только  женского  пола.  Предимплантационная  диагностика  проводится  на  3-е  сутки  развития  эмбриона,  когда  он  состоит  из  6—8  клеток  называемых  бластомерами.  При  этом  эмбриолог  в  лабораторных  условиях  забирает  одну  клетку  из  развивающегося  эмбриона  и  проводит  ее  генетическое  исследование.  Данная  процедура  безвредна  для  будущего  ребенка,  так  как  на  этой  стадии  развития  эмбрион  компенсирует  изъятую  клетку  за  счет  особого  свойства  —  превращаться  в  любую  ткань  организма.

С  учетом  вышеизложенного  пациенты  с  данной  патологией  должны  быть  всесторонне  проинформированы  для  принятия  решения  о  применении  ВРТ  и  возможных  дополнительных  исследованиях.  Поэтому  перед  планируемым  экстракорпоральным  оплодотворением  (ЭКО)  в  рамках  обследования  супружеской  пары  мужчинам  с  азооспермией  и  олигозооспермией  тяжелой  степени  необходимо  провести  молекулярно-генетический  анализ  Y-хромосомы.  Так  как  при  микроделециях  AZFa  и  AZFb  субрегионов  зрелые  половые  клетки  отсутствуют  в  яичке,  проведение  диагностической  биопсии  у  данных  пациентов  не  показано.  Следовательно,  пациентам  с  данной  генетической  аномалией  необходимо  рекомендовать  иные  пути  решения  репродуктивных  проблем:  донорские  программы  или  усыновление.  Наличие  AZF  микроделеций  обусловливает  неэффективность  консервативного  лечения,  направленного  на  активацию  сперматогенеза,  с  целью  увеличение  количества  сперматозоидов.  Вместе  с  тем  у  лиц  с  утратой  AZFс  субрегиона  при  подготовке  к  ВРТ  необходима  терапия,  направленная  на  коррекцию  гормонального  и  метаболического  статуса  мужчины  для  получения  морфологически  качественных  сперматозоидов.

Для  дифференциальной  диагностики  обструктивных  и  необструктивных  форм  мужского  бесплодия  могут  использоваться  рентгенконтрастное  исследование  проходимости  семявыносящих  путей,  трансуретральная  катеттеризация  устья  семявыносящего  протока  и  др.  Однако,  в  настоящее  время  у  пациентов  с  азооспермией  наибольшее  распространение  получила  пункционная  биопсия.  Данная  процедура  носит  как  диагностический,  так  и  лечебный  характер,  т.  к.  при  наличии  в  биоптате  единичных  сперматозоидов  их  можно  в  дальнейшем  использовать  при  проведении  такого  метода  ВРТ  как  ICSI.  Хороший  прогноз  в  плане  получения  сперматозоидов  хорошего  качества  в  процессе  биопсии  обычно  наблюдается  при  достаточном  объеме  яичек  и  нормальном  уровне  гонадотропинов:  фолликулостимулирующего  (ФСГ)  и  лютеонизирующего  (ЛГ)  гормонов.  Существует  большое  разнообразие  методов  проведения  данной  процедуры,  такие  как  TESA  (чрезкожная  аспирация  сперматозоидов  из  яичка),  TESE  (экстракция  сперматозоидов  из  яичка  при  открытой  биопсии),  PESA  (чрезкожная  аспирация  сперматозоидов  из  придатка  яичка),  MESA  (микрохирургическая  аспирация  сперматозоидов  из  придатка  яичка).  На  наш  взгляд  наиболее  приемлемым  и  часто  используемым  является  TESA  -  чрезкожная  аспирационная  биопсия  яичка,  в  связи  с  простотой  ее  выполнения  и  малоинвазивностью  [1,  7,  8].

Цель:  обосновать  практическую  значимость  проведения  генетического  обследования  мужчин  с  тяжелой  патоспермией  при  подготовке  к  ВРТ.

Задачи:

1.  Проанализировать  структуру  причин  бесплодия;

2.  Определить  частоту  генетической  патологии  среди  пациентов  с  азооспермией  и  олигозооспермией  тяжелой  степени,  обратившихся  для  лечения  бесплодия;

3.  Проанализировать  структуру  причин  азооспермии  и  олигозооспермии  среди  обследуемых  пациентов;

4.  Определить  соотношение  различных  видов  мутаций  AZF  региона  Y  хромосомы,  мутаций  гена  CFTR;

5.  Оценить  эффективность  вспомогательных  репродуктивных  технологий  среди  пациентов  в  исследуемой  группе.

Материал  и  методы

Исследуемую  группу  составили  1904  мужчин,  из  большего  числа  семей  обратившихся  в  «Центр  репродуктивной  медицины»  г.  Минска  по  поводу  бесплодия  за  период  с  2011  по  2013  гг.  Обследование  проводилось  в  соответствии  со  стандартами  ВОЗ  и  Европейской  ассоциации  урологов.  У  189  (9,9  %)  мужчин  (средний  возраст  32  года)  с  установленным  диагнозом  азооспермии  и  тяжелой  олигозоосперми  проводился  анализ  кариотипа  и  молекулярно-генетический  анализ.

Для  проведения  хромосомного  анализа  периферической  крови  использовались  стандартные  культуры  и  метод  GTL-banding.

Определение  микроделеций  AZF  региона  Y  хромосомы  и  мутаций  трансмембранного  регуляторного  белка  муковисцидоза  (CFTR  мутации)  производился  при  помощи  ПЦР  [4]  с  дальнейшим  анализом  при  автоматическом  капиллярном  электрофорезе  и  обработкой  результатов  с  использованием  программного  обеспечения  GenneMapper  4.1.

Результаты  и  обсуждение

Согласно  показаниям  на  наличие  мутаций  AZF  региона  Y  хромосомы  обследовано  584  человека,  в  том  числе  всем  189  пациентам  с  азооспермией  и  тяжелой  олигозооспермией.  Из  них  микроделеции  обнаружены  в  34  (5,8  %)  случаях.  Соотношение  мутаций  следующее:  делеция  субрегиона  AZFc  —  27  (4,6  %)  случаев,  AZFb  —  2  (0,3  %),  AZFb+c  –  3  (0,5  %)  и  делеция  всех  трех  субрегионов  a+b+c  (de  la  Chapelle  syndrome)  у  2  (0,3  %)  обследуемых.

Кроме  исследования  мутаций  AZF  региона  Y  хромосомы  в  601  семье  проводился  молекулярно-генетический  анализ  на  наличие  мутаций  трансмембранного  регуляторного  белка  муковисцидоза  (CFTR).  Он  выявил  гетерозиготное  носительство  данной  мутации  у  16  (2,7  %)  пациентов.  Из  них  мутация  F508del  —  10  (1,7  %),  мутация  CFTRdel  (2,3)  —  3  (0,5  %)  случая,  мутация  2184insA  —  2  (0,3  %)  и  мутация  1677delTA  —  1  (0,2  %)  случаев.  Итоговое  решение  по  этим  пациентам  принималось  по  совокупным  данным  с  результатами  аналогичного  исследования  у  супруг.

Анализ  кариотипа  при  тяжелой  патоспермии  позволил  установить  наличие  синдрома  Кляйнфельтера  у  3  (1,59  %)  мужчин  из  189  обследованных.

После  вирификации  диагноза  и  установления  генетических  причин  бесплодия  производился  отбор  кандидатов  для  проведения  биопсии  яичка  с  последующей  криоконсервацией  полученных  сперматозоидов.  По  показаниям  биопсия  яичка  проводилась  у  132  пациентов.  В  107  (81,1  %)  случаях  сперматозоиды  были  получены  и  процедура  оказалась  эффективной.

Полученный  после  биопсии  яичка  криоконсерват  использовался  для  проведения  ICSI.  На  3-е  сутки  развития  эмбриона  проводилась  предимплантационная  диагностика  пола  плода  с  целью  исключения  наследования  репродуктивных  проблем  отца.  Из  62  произведенных  процедур  ЭКО  беременность  супруг  пациентов  наступила  в  24  (38,7  %)  случаях.

Заключение

1. В  структуре  причин  бесплодия  на  долю  азооспермии  и  олигозооспермии  тяжелой  степени  приходится  31,6  %.
2. Частота  генетической  патологии  и  аномалии  кариотипа  среди  пациентов  с  азооспермией  встречаются  в  25,9  %,  а  у  мужчин  с  олигозооспермией  в  12,1  %  случаев.
3. В  структуре  причин  азооспермии  преобладают  3  патологии:  обструктивная  азооспермия,  гипогонадизм  и  микроделеции  AZF  региона  Y  хромосомы.  В  структуре  причин  олигозооспермии  на  долю  воспалительных  заболеваний,  гипогонадизма  и  травм  и  операций  на  органах  половой  сферы  приходится  78,6  %.
4. Среди  пациентов,  имеющих  микроделеции  AZF  региона  Y  хромосомы  наиболее  частой  и  прогностически  благоприятной  является  делеция  AZFc  субрегиона  и  наблюдается  в  79,4  %  случаев.
5. Эффективность  биопсии  яичка  по  методике  TESA  среди  пациентов  исследуемой  группы  составила  81,1  %.  Процедура  ЭКО+ICSI  с  использованием  криоконсервата  полученного  после  биопсии  оказалась  эффективной  в  38,7  %  случаев.

Список  литературы:

1. Андрология.  Мужское  здоровье  и  дисфункция  репродуктивной  системы:  пер.  с  англ.  /  под  ред.  Э.  Нишлага,  Г.М.  Бере.  М.:  МИА,  2005.  —  554  с.
2. Артифексов  С.Б.  Фармакотерапия  в  андрологии.  М.,  2008.  —  117  с.
3. Божедомов  В.А,.  Теодорович  О.В.  Эпидемиология  и  причины  аутоиммунного  мужского  беслодия  /  //  Урология.  —  2005.  —  №  1.  —  С.  35—37.
4. Барсуков  А.Н.  Итоги  работы  организаций  здравоохранения,  оказывающих  медицинскую  помощь  матерям  и  детям  в  2009  году.  Задачи  на  2010  г.//  Репродуктивное  здоровье  в  Беларуси:  —  2010.  —  №  2.  —  стр.  12—25.
5. Гамидов  С.И.  Мужское  бесплодие:  современное  состояние  проблемы  //  Фарматека.  —  2009.  —  №  9.  —  С.  12—17.
6. Корякин  М.В.,  Акопян  А.С.  Анализ  причин  мужского  бесплодия  //  Пробл.  репродукции.  —  2000.  —  №  5.  —  С.  68—74.
7. Кулаков  В.И.  Лечение  женского  и  мужского  бесплодия.  Вспомогательные  репродуктивные  технологии/  Кулаков  В.И.  [и  др.]//М.:  МИА,  2005.  —  592  с.
8. Леонов  Б.В.  Наш  опыт  применения  метода  интрацитоплазматической  инъекции  сперматозоида  в  программе  экстракорпорального  оплодотворения  и  переноса  эмбриона  в  полость  матки/  Леонов  Б.В.  [и  др.]//Акушерство  и  гинекология.  —  1999.  —  №  4.  —  С.  35—38.
9. Международная  статистическая  классификация  болезней  и  проблем,  связанных  со  здоровьем:  10  пересмотр  /  ВОЗ.  М.:  Медицина,  —  1995.  —  Т.  1,  —  ч.  2.  —  633  с.
10. Моссэ  К.А.,  Моссэ  Н.И.,  Гончар  А.Л.  ДНК-анализ  микроделеций  AZF  хромосомы  Y  для  диагностики  причин  мужского  бесплодия  //  Сборник  науч.  тр.  РНПЦ  «Мать  и  дитя»  Минск.  —  2011.  —  Вып.  4.  —  С.  278—282.
11. Сухих  Г.Т.,  Назаренко  Т.А.  и  др..  Бесплодный  брак.  Современные  подходы  к  диагностике  и  лечению:  руководство.  М.,  2010.  —  22  с.
12. Сухих  Г.Т.,  Тер-Аванесов  Г.В.,  Назаренко  Т.А.  и  др.  Мужское  бесплодие:  этиопатогенез,  диагностика  и  лечение.  М.,  2007.  —  104  c.
13. Тер-Авнесов  Г.В.  Мужское  бесплодие:  этиопатогенез,  диагностика  и  лечение/  Тер-Авнесов  Г.В.//Москва,  2007.  —  114  с.
14. Черных  В.Б.,  Чухрова  А.Л.,  Бескоровайная  Т.С.  и  др.  Типы  делеций  Y-хромосомы  и  их  частота  у  мужчин  с  бесплодием.  Генетика  2006;42:8:1130-1136.
15. Юшко  Е.И.,  Жуковская  С.В.,  Игнатьева  Т.В.,  Линник  А.И.  Оценка  результатов  тестикулярной  биопсии  и  криоконсервации  биоптата  в  программе  лечения  мужского  бесплодия.//  Здавохранение  :  —  2010.  —  №  8.  —  С.  63—66.
16. Ferlin  A.,  Arredi  B.,  Speltra  E.  et  al.  Molecular  and  clinical  characterization  of  Y  chromosome  microdeletions  in  infertile  men:  a  10-year  experience  in  Italy.  J  Clin  Endocrinol  Metab  2007;92:3:762-770.
17. Gates  R.D.,  Silber  S.,  Brown  L.G.,  Page  D.C.  Clinical  characterization  of  42  oligospermic  or  azoospermic  men  with  microdeletion  of  the  AZFc  region  of  the  Y  chromosome,  and  of  18  children  conceived  via  ICSI  //  Hum.  Reprod.  —  2002.  —  Vol.  17,  —  №  11.  —  P.  2813—2824.
18. Hernandez  U.L.,  Cervera-Aguilar  R.  Frequency  and  etiology  of  azoospermia  in  the  study  of  infertile  couples  //  Gynecol.  Obstet.  —  2005.  —  Vol.  69.  —  P.  322—326.
19. Irvine  D.S.  Epidemiology  and  etiology  of  male  infertility  //  Hum.  Reprod.  —  1998.  —  Vol.  13,  —  suppl.  1.  —  P.  33—44.
20. Kent-First  M.G.,  Kol  S.,  Muallem  A.  et  al.  The  incidence  and  possible  relevance  of  Y-linked  microdeletions  in  babies  born  after  intracytoplasmic  sperm  injection  and  their  infertile  fathers  //  Mol.  Hum.Reprod.  —  1996.  —  Vol.  2.  —  P.  943—949.
21. Reed  M.L.,  Fzeh  P.C.,  Hamic  A.  et  al.  Soy  lecithin  replaces  egg  yolk  for  cryopreservation  of  human  sperm  without  adversely  affecting  postthaw  motility,  morphology,  sperm  DNA  integrity,  or  sperm  binding  to  hyaluronate  //  Fertil.  Steril.  —  2009.  —  Vol.  92,  —  №  5.  —  P.  1787—1790. 
22. Siffroi  J.P.,  Le  Bourhis  C.,  Krausz  C.  et  al.  Sex  chromosome  mosaicism  in  males  carrying  Y  chromosome  long  arm  deletions  //Hum.  Reprod.  —  2000.  —  Vol.  15,  —  №  12.  —  P.  2559—2562.
23. Tiepolo  L.,  Zuffardi  O.  Localization  of  factors  controlling  spermatogenesis  in  the  non  fluorescent  portion  of  the  human  Y  chromosome  long  arm.  Hum  Genet  1976;  34:  119-124.
24. Vogt  P.H.,  Edelmann  A.,  Kirsh  S.  et  al.  Human  Y  chromosome  azoospermia  factors  (AZF)  mapped  to  different  subregions  in  Yql1.  Hum  Mol  Genet  1996;  5:  933-943. 
25. Vutyavanich  T.,  Piromlertamorn  W.,  Nunta  S.  Rapid  freezing  versus  slow  programmable  freezing  of  human  spermatozoa  //  Fertil.  Steril.  —  2010.  —  Vol.  93,  —  №  6.  —  P.  1921—1928.
26. Wolfw  J.,  Bryant  G.  Cryobiology  and  anhydrobiology  of  cells.  Sydney,  2004.
27. World  Health  Organization.  Laboratory  manual  for  the  examination  of  human  semen  and  sperm-cervical  mucus  interaction.  Cambridge  University  press.  Cambridge.2001.
28. World  Health  Organization.  Manual  for  the  standardized  investigation  and  diagnosis  of  the  infertile  couple.  Cambridge  University  Press,  Cambridge,  1993.