ПРИМЕНЕНИЕ АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ В ПРОЦЕССЕ СПИРТОВОГО БРОЖЕНИЯ

Этиловый спирт широко используется как в пищевой промышленности, так и других сферах экономики (технической, энергетической, сельскохозяйственной). Пищевая промышленность постоянно наращивает темпы производства спиртовой и ликероводочной продукции, расширяется ее ассортимент[2, 4].

Одним из актуальных направлений в производстве этилового спирта является совершенствование биотехнологических процессов, связанных с применением ферментов. Речь идет о замене солода современными ферментными препаратами, прежде всего микробного происхождения. Создание комплексных ферментных препаратов позволяет более глубоко осуществить ферментативный гидролиз углеводов (в частности, крахмала), тем самым полнее сбродить сусло до основного продукта - этилового спирта. Изучение комплекса ферментов для более быстрого и глубокого гидролиза крахмала и других углеводов с целью интенсификации процесса и существенного повышения выхода спирта из единицы перерабатываемого сырья весьма актуально. На современном этапе микробной биотехнологии разработан целый ряд ферментных препаратов, обладающих направленным влиянием на ключевые процессы получения спирта - осахаривание и брожения[4].

В последние годы решение вопроса экономии тепло- и энергоресурсов на спиртовых заводах является одной из наиболее острых проблем. В связи с этим предприятия отрасли внедряют на своих производствах ресурсосберегающие технологии. Под ресурсосберегающей технологией подразумевается переработка сырья в условиях пониженных температур. Внедрение на спиртовом заводе такой технологии позволяет снизить потребление тепла, электроэнергии на 20-25% и воды на 30-40%, благодаря чему снижается себестоимость конечной продукции и повышается ее конкурентоспособность на рынке. При реализации таких технологий возникает целый ряд технологических проблем, и одной из основных при этом является повышение эффективности применяемого комплекса ферментных препаратов[8, 9].

Характерной особенностью ресурсосбе­регающей технологии является переработка концентрированных сред. При этом возникают проблемы, связанные с повышенной вязкостью полупродуктов. В такой ситуации основную роль при снижении вязкости полупродуктов играют не температурно-временные режимы, а комплекс ферментных препаратов при условии интенсивной гидродинамики[1].

Кроме того, большинство схем предусматривает двухступенчатую водно-тепловую обработку при различных температурах, поэтому применяемые амилолитические ферменты должны обладать высокой активностью в широком диапазоне температур от 60 до 100°С.

Стоит также отметить, что при работе механико-ферментативных схем имеет место развитие посторонней кислотообразующей микрофлоры, вследствие чего рН среды может снизиться с 6,0-6,5 до 5,0-4,5, а так как оптимум действия α-амилаз в основном находится на уровне 5,5-6,0, то происходит значительное снижение активности разжижающих ферментов. Для исключения развития в замесе посторонней микрофлоры зерновое сырье должно подвергаться глубокой очистке и обеззараживанию. Данные технологические приемы позволяют практически полностью исключить развитие в полупродуктах нежелательных микроорганизмов, что позво­ляет повысить стабильность технологии на всех стадиях, в том числе и на этапе ферментативной обработки, и повысить качество получаемого продукта. В настоящее время ресурсосберегающая технология с глубокой очисткой сырья реализована на некоторых заводах России, Беларуси[1-4].

Как показали результаты, применение такой схемы приготовления замеса позволяет осуществлять дальнейшую его тепловую обработку при подборе соответствующих ферментных препаратов при температуре не выше 60°С. При этом достигается значительная экономия энерго- и теплоресурсов и упрощается аппаратурная схема за счет совмещения стадий водно-тепловой обработки и осахаривания.

Целью настоящей работы являются определение оптимальных режимов (по показателю рН и температуре) сохранения ферментативной активности для амилолитических ферментов, входящих в состав композиции, а также исследование действия экспериментально подобранной энзимной композиции на субстрат, с целью осуществления глубокого ферментативного гидролиза углеводов с полным сбраживанием сусла при наименьших энергетических затратах.

Обьектами исследования являются ферментные препараты α-амилаза и глюкоамилаза, полу­ченные путем микробиологического синтеза при культивировании штаммов Bacillus subtilis, Aspergillus awamori.

Для определения оптимальных режимов сохранения ферментативной активности для амилолитических ферментов при различных значениях рН и температуры использовали: сухой препарат глюкоамилазы с активностью 5366 ед/г и амилазы с активностью 4879 ед/г растворяли в 0,05 М фосфатно-ацетат­ном буфере. Полученный раствор титровали в диапазоне рН от 2 до 12, используя 10-ти и 40%-ные растворы гидроксида натрия, а также 15%-ный раствор уксусной кислоты.

Навеску сухого препарата глюкоамилазы с активностью 5366 ед/г и амилазы с активностью 4879 ед/г растворяли в 0,05 М фосфатно-ацетатном буфере. Помещали раствор ферментов в объеме по 2 мл в пробирки, укупорив резиновыми пробками. Выдерживали в сушильном шкафу в течение 1 часа, в температурном диапазоне от 40 до 95°С, с последовательным увеличением температуры на 10°С.

Содержание глюкозы определяли глюкозооксидазным методом, содержание крахмала - спектрофотометрически с использованием йодного раствора при длине волны 580 нм по калибровочной зависимости оптической плотности от концентрации растворов.

При оценке ферментативной активности амилазы использовали спектрофотометрический метод (длина волны 656 нм) определения продуктов гидролиза крахмала ферментами амилолитического комплекса до декстринов различной молекулярной массы. За единицу активности амилазы АС принимали такое количество ферментов, которое в строго определенных условиях (температура 45°С, рН 6,7 в течение 1 мин) катализирует до декстринов различной молекулярной массы 1 г растворимого крахмала.

При определении глюкоамилазной активности применяли глюкозооксидазный метод, основанный на определении глюкозы, образующейся при гидролизе растворимого крахмала ферментом. Глюкоамилазная активность характеризует способность ферментного препарата катализировать расщепление растворимого крахмала до глюкозы и выражается числом единиц активности в 1 г препарата. За единицу глюкоамилазной активности принята способность фермента катализировать гидролиз растворимого крахмала при определенных условиях температуры и рН (30°С, рН 6,5), высвобождая за 1 мин 1 мкмоль глюкозы.

Для проведения стадии гидролиза субстрата и процесса брожения, композицию амилаз, содержащую ферменты а-амилазу и глюкоамилазу в соотношениях 3:7, вносили в исследуемый субстрат, нагретый до температуры 50-55°С, выдерживали в течение 2 час, охлаждали до температуры 30°С. Далее засевали культурой Sacharomyces и проводили инкубирование в термостате при температуре 28-30°С в течение 3 суток. Затем из полученной барды отгоняли этанол. Процесс осахаривания контролировали по степени гидролиза крахмала и конверсии его в глюкозу, которая после сбраживания превращалась (синтезировалась) в этиловый спирт.

Спирт определяли, используя метод отгонки, с применением раствора двухромовокислого калия, содержащего азотную кислоту. Количество образовавшегося трехвалентного хрома фиксировали на фотоэлектроколориметре при длине волны 660 нм. В зависимости от количества этилового спирта, вступившего в реакцию, происходило изменение окраски раствора от оранжевой до сине-зеленой. Содержание спирта в исследу­емом растворе определяли по калибровочной зависимости оптической плотности раствора продуктов реакции от количества введенного стандарта эталона.

Основные параметры, при помощи которых осуществляется управление процессами ферментолиза, являются рН и температура. При этом хорошо известно, что для каждого типа ферментов существует свой интервал изменения рН и температуры, в котором ферментативная активность максимальна[9].

Вследствие этого, в процессе ферментативного гидролиза под действием композиции амилаз возникает необходимость изучения зависимости ферментативной активности энзимов, составляющих композицию, от рН и температуры, поскольку максимумы активности у разных ферментов, входящих в состав препарата, могут быть различны. Отсюда требуется подбор таких условий ферментолиза, при которых достигается оптимум общей энзиматической активности ферментов, входящих в состав композиции, по отношению к таким факторам как рН и температура[5-7].

Результаты данных по влиянию показателя рН на ферментативную активность представлены на рисунках 1 и 2 в виде графика зависимости амилолитической активности от значений рН.

Рисунок 1. График зависимости активности a-амилазы от pH

Рисунок 2. График зависимости активности глюкоамилазы от pH

Как следует из данных, представленных на графиках, максимальное значение рН для амилазы находится в пределах значений 6,5-7,0. Интервал стабильности рН с учетом погрешности измерений находится в пределах от 5,8 до 8,0. Для глюкоамилазы максимальное значение рН, при котором ферментативная активность сохраняет наибольшую активность - 6,0, а интервал стабильности рН с учетом погрешности измерений, находится в пределах от 5,0 до 7,0.

Результаты данных по влиянию показателя температуры на ферментативную активность представлены на рисунках 3 и 4 в виде графика зависимости амилолитической активности от температуры.

Рисунок 3.Влияние показателей температуры наферментативную активность

Рисунок 4. Влияние показателей температуры наферментативную активность

Как следует из данных, представленных на графиках, для глюкоамилазы и амилазы максимальное значение температурного показателя находится на уровне 40-45°С. Интервал стабильности температуры, с учетом погрешности измерений, находится в пределах 35-50°С.

С учетом полученных данных установлено, что оптимум активности для обоих ферментов составил по показателю рН - 6,5-6,7, а оптимальные значения температуры - 45-50°С.

 Схема получения этанола включает следующие стадии: крахмальный замес смешивается с ферментами и нагревается до температуры, оптимальной для их действия. Под действием разжижающих ферментов (а-амилаз) и повышенных температур молекулы крахмала распадаются на низко- и среднемолекулярные декстрины и сахара. Полученный раствор охлаждается и в него добавляется осахаривающие ферменты (глюкоамилазы). Осахаривающие ферменты преобразовывают молекулы декстрина в простые сахара, способные перерабатываться дрожжами в этанол. В осахаренное сусло добавляют дрожжи, которые преобразуют молекулы сахаров в этанол и углекислый газ. Процесс брожения длится 72 часа. За этот период все доступные сахара сусла перерабатываются в этанол и углекислый газ. Полученная в результате брожения бражка содержит до 10% этанола[3, 4].

С целью одновременного разжижения и осахаривания субстрата под действием ферментов проведены экспериментальные исследования по ферментативному гидролизу крахмалосодержащего сырья под действием композиции амилаз[1, 7].

Таким образом, с использованием композиции амилолитических ферментов происходит одновременное разжижение и осахаривание субстрата. Гидролиз происходит при одинаковых значениях величины рН, при этом из технологического цикла исключаются стадии поддержания рН для каждого фермента по отдельности.

Список литературы:

1. Мальцев, П.М. Химико-технологический контроль производства солода и пива / П.М. Мальцев. - М: Пищевая промышленность, 1976. - 446 с.
2. Рухлядева, А.П. Методы определения активности гидролитических ферментов /А. П. Рухлядева. - М: Легкая и пищевая промышленность, 1981. - 36, 82 с.
3. Anson, M.L. The estimation of pepsin, trypsin, papain and catepsin with hemoglobin/M.L.Anson.-J. Gen. Physiol. 1938.Vol. 22. P. 79-82.
4. Buleon, A., Colonna, P., Planchot, V., Ball, S. /A.Buleon.- Int. J. Biol. Macromol. 1998. - V.23, - P.85-112.
5. Lowry O.H., Rosebrougt N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent /O.N.Lowry.- J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265.
6. Manners       D. J. // Carbohydrate polymers/D.J.Manners. - J. Biol. Chem .1989. - V. 11. - P. 87-112.
7. Nabeshima E.H. Grossmann M.V. Carbohydrate Polymers/E.N.Nabeshima .-J. Biol. Chem 2001, V.45, 347-353.
8. Tester R. F., Karkalas Q. J.Gereal scince/R.F.Tester.- J. Biol. Chem - 2004. - V. 39.
9. Zoble H. F.Starch/H.F.Zoble.- - 1988. - V. 40. - P.1-7.