ЗИМОВКА РЫБ В ИСКУССТВЕННЫХ ВОДОЕМАХ

В северных районах России многие мелкие непроточные озёра и пруды в суровые зимние месяцы промерзают до дна. Да и в средней полосе это не редкость. Поздней осенью рыбы, населяющие такие водоёмы, обычно зарываются в ил и благополучно переносят зиму.

Однако иногда возникают экстремальные ситуации, когда возможности зарыться нет или промерзание настолько глубокое, что затрагивает придонные слои ила. Рыбы оказываются вмёрзшими в лёд. И, что удивительно, находясь в ледяном плену, рыбы остаются живыми. Весной они постепенно оттаивают и восстанавливают нормальную физиологическую активность. Конечно, такая поразительная выносливость свойственна лишь немногим видам рыб. Они, скорее, исключение из общего правила: при замораживании практически все рыбы погибают.

В статье рассмотрены возможные причины морозоустойчивости рыб и других живых организмов, выдерживающих длительные низкотемпературные периоды.

Ни для кого не секрет, что в тридцатиградусные морозы почки деревьев и кустарников остаются живыми. Каждую весну мы получаем убедительное тому доказательство. А ведь температура внутри почки равна температуре окружающей среды, никаких «обогревательных устройств» у дерева нет. Тоже самое происходит с яйцами, личинками и куколками некоторых насекомых, зимующими под корой деревьев и в стеблях растений, и даже с самими насекомыми. Их температура совпадает с температурой окружающей среды, и, тем не менее, жидкости в их теле не замерзают. И, что самое удивительное, некоторые рыбы, тоже могут зимовать в толще льда и оставаться живыми. В чём здесь дело?

В теории растворов выводится формула для температуры замерзания раствора в зависимости от его концентрации:

где Т_р - температура замерзания раствора в кельвинах, Т - температура замерзания растворителя, с и q - плотность и удельная теплота плавления растворителя, c - молярная концентрация раствора, R - газовая постоянная. Таким образом, температура замерзания раствора зависит только от его молярной концентрации, но не зависит от химической природы растворённого вещества. Поэтому формулу можно использовать и в случае, когда в одном объёме растворено несколько различных веществ. Тогда в качестве c берётся суммарная молярная концентрация всех компонентов раствора.

Из формулы следует, что с ростом концентрации температура замерзания раствора понижается. Например, если растворить 30 г поваренной соли в 100 г воды, то рассчитанная по формуле температура замерзания такого раствора примерно -18 °С, что неплохо согласуется с экспериментальными данными. При дальнейшем понижении температуры весь раствор не промёрзнет. Часть воды превратится в лёд в виде объединения огромного количества небольших кристаллов, а другая часть останется в растворе, концентрация которого уже будет больше исходной, и температура замерзания соответственно понизится. На вид получится масса мокрого рыхлого льда.

Живой организм можно условно считать водным раствором: внутри- и внеклеточные жидкости - это сложные многокомпонентные растворы солей, углеводов, белков и других соединений. Чем выше общая концентрация тканевых растворов c, тем ниже температура их замерзания.

Если зимой в сильный мороз разрезать почку дерева, то внутри мы увидим влажную рыхлую массу, состоящую из микроскопических кристалликов льда во внеклеточном растворе. Ситуация очень похожа на эксперимент с замораживанием раствора соли. Только в отличие от чашки с раствором почка более тонкая структура, состоящая из большого количества клеток. К зиме суммарная концентрация тканевых растворов увеличивается, что приводит к понижению температуры замерзания почки. Кроме того, в клетках синтезируются белки-антифризы «контролирующие» процесс образования льда. При умеренных морозах кристалликов льда в почках нет. При сильном морозе во внеклеточных растворах (как менее концентрированных) образуются микроскопические кристаллы льда, не повреждающие клеточных стенок. Концентрация внеклеточного раствора автоматически увеличивается, и температура его замерзания соответственно падает. Так клетки переносят зиму. И не только клетки почек деревьев, но и клетки некоторых животных.

В засохших стеблях полыни, репейника, пижмы, тысячелистника зимуют личинки различных насекомых, например, жука-долгоносика - фрачника перевязанного (Lixus fasciculatus), жука-усача (Phytoecia pustulata), жука-горбатки (Mordellistena weisei) и др. В пятнадцатиградусный мороз они даже шевелятся. Никаких кристалликов льда в их тканях нет.

Более сложные животные, например, некоторые рыбы, тоже бывают морозоустойчивыми, о чём свидетельствуют ряд авторов, а также собственные наблюдения. Вот что пишет кандидат биологических наук Е. Цепкин, старший научный сотрудник кафедры ихтиологии МГУ [3,128]. «Труднее всего приходится рыбам, постоянно живущим в мелких непроточных озёрах арктической области, - обыкновенному карасю (Carassius carassius), и чёрной рыбе - даллии (Dallia pectoralis). С наступлением зимы они зарываются в ил. Но в крайне суровых условиях севера такие водоемы промерзают до самого дна, и рыбы часто оказываются вмёрзшими в лёд. Их выносливость к низким температурам просто поражает. Даже находясь в ледяном плену, рыбы остаются живыми, разумеется, при условии, что их полостные жидкости и кровь в сосудах не перейдут в твёрдое состояние. Известен случай, когда голодная собака проглотила покрытую ледяным панцирем даллию, а потом отрыгнула её. Оттаявшая в собачьем желудке рыбка оказалась живой».

Похожие эксперименты проходят у нас с 2004 года с серебряными карасями (Carassius auratus gibelio) и ротанами-головешками (Perccottus glenii). В последнем эксперименте, который длится уже около 5 лет подряд, бассейном служит миниатюрный водоём, уложенный по дну полиэтиленовой пленкой. Его длина 3 м, ширина 1 м, а глубина не превышает 60 см. Каждую зиму водоём полностью промерзает. Весной, когда снег исчезает, а лёд в водоёме подтаивает, на поверхность воды всплывает кусок льда в форме дна самого глубокого места в бассейне с вмёрзшим песком, листьями и пр. Это свидетельствует о том, что вся вода действительно промерзает. На протяжении всего эксперимента рыбы кормились тем, что попадало в воду снаружи, образовывалось в толще воды или на дне (никакой подкормки не было). Обычно в воду падали кусочки земли с клумбы, листья винограда и случайные насекомые, в толще воды появлялась тина, а на дно изредка попадали дождевые черви. Что интересно, после первой зимовки караси прекратили расти. Возможно, вся энергия, полученная рыбами от предельно скудной пищи идёт только на поддержание жизни и подготовку к замерзанию. А после второй зимовки из-за неправильного размораживания у ротана произошла деформация позвоночника. Но ротан живёт в таком положении уже около четырех лет.

Первые опыты проводились с ротаном в более жёстких условиях. Рыба жила в обычной чугунной ванне, слегка вкопанной в землю и закрытой пробкой, примерно 2,5 года (2004-2006 г.), перезимовав два раза. Зимовки оказались очень суровыми. В первую зиму температура опускалась ниже тридцати и держалась около недели. Промерзание воды в ванне полное, зарыться некуда; в такой мороз температура льда на дне с учётом теплового потока от земли не выше -20 °С. Однако, в конце марта ротан постепенно оттаял, вышел из оцепенения, а к середине мая восстановил физиологическую активность и с большим аппетитом ел дождевых червей. Вторая зимовка тоже прошла удачно, но осенью рыба, по-видимому, проглотила ядовитое или слишком жёсткое насекомое, и начались проблемы с пищеварением, несовместимые с жизнью, о чём свидетельствовали слизистые выделения из пищеварительного тракта.

Эксперимент с другим ротаном прошёл неудачно. Новая рыбка не перенесла и первой достаточно мягкой зимы. Во время длительной оттепели произошло размораживание рыбы, а затем подморозило, и вторичного замерзания организм не выдержал. Повторного замораживания за один сезон даже морозоустойчивые рыбы не переносят.

Устойчивость многих организмов к температурам ниже 0 °С сильно изменяется в течение жизненного цикла, связанного с сезонами года. Так, у насекомых и растений холодоустойчивость и морозоустойчивость сильно повышаются при переходе к состоянию покоя ещё до наступления морозов. В начале периода покоя при температурах немного выше 0 °С происходят значительные перестройки в обмене веществ и физико-химическом состоянии клеток, повышающие устойчивость организмов. Накапливаются жиры, гликоген, сахара, образуются защитные вещества, изменяется состояние воды и белков в клетках. Насекомые приобретают способность сильно переохлаждаться иногда до -40 °С или ещё ниже. Некоторые виды насекомых и растений перезимовывают в замёрзшем состоянии. Хорошо переносят низкие и даже сверхнизкие температуры многие микроорганизмы (бактерии, дрожжи), мхи, лишайники и др. Обычно их холодоустойчивость связана с быстрым обезвоживанием, повышенной вязкостью цитоплазмы, наличием оболочки, препятствующей проникновению кристаллов в клетку, и др. Жизнедеятельность организмов (исключая теплокровных животных) прекращается обычно при температурах несколько ниже 0 °С, но некоторые процессы обмена веществ могут протекать при температурах около -20 °С (например, дыхание, фотосинтез) и даже ниже. В связи с этим представляет интерес малоизученная биология морских организмов, обитающих на подводных льдах Антарктики [2, с. 42-55].

Научные основы криобиологии - науки, изучающей действие низких и сверхнизких температур на живые системы - заложены в конце XIX века русским учёным П. И. Бахметьевым, изучавшим явление переохлаждения у насекомых и анабиоз у летучих мышей. В дальнейшем выяснилась способность различных организмов (микроорганизмы, беспозвоночные - тихоходки, коловратки, нематоды), а также спор и семян переносить в высушенном состоянии глубокое охлаждение (до -271 °С, то есть до температур, близких к абсолютному нулю).

Одна из основных проблем криобиологии - выяснение процессов, сопровождающих охлаждение живых систем и ведущих к необратимым повреждениям. Причин, вызывающих повреждения при охлаждении и замерзании, много. Большое значение имеет скорость замораживания и размораживания. При охлаждении лёд сначала образуется в окружающей клетку жидкости как в менее концентрированной. Концентрация внеклеточного раствора постепенно увеличивается. Когда эта концентрация превысит концентрацию внутриклеточного раствора, вследствие осмоса клетка начнёт терять воду. Обезвоживание вызовет повышение концентрации электролитов в клетке. Некоторые клетки из-за этого погибают. Чтобы сохранить живыми клетки растений и животных, требуется очень медленное охлаждение (в природе, как правило, так и происходит), при котором не происходит резкого изменения концентрации веществ в клетке.

Кроме того, быстрое охлаждение может привести к температурному шоку и гибели клеток [1, с. 20]. Каждый фермент имеет свой температурный оптимум, то есть температуру, при которой он работает с максимальной скоростью. При быстром изменении температуры происходит быстрое изменение скоростей работы всех ферментов, и биохимические реакции становятся несогласованными. Это и есть температурный шок. Клетка не успевает адаптироваться к таким изменениям и гибнет.

Скорость размораживания и нагревания живых систем тоже очень важный фактор, поскольку считается, что во время этих процессов происходят основные повреждения в клетках. Причина этих повреждений - перекристаллизация, сопровождающаяся значительным увеличением размеров кристаллов льда.

Не вдаваясь в детали, приведем примерную последовательность процессов технологии замораживания и размораживания живых клеток, а также некоторых тканей и органов [1, с. 19-21].

Подготовка среды к замораживанию.

При понижении температуры кислород выходит из-под контроля ферментативных систем и усиливает свободнорадикальное окисление всех активных биомолекул: нуклеиновых кислот, белков и др. Поэтому в среду вводят ингибиторы свободнорадикального окисления - биоантиокислители или антиоксиданты, (токоферол, глютатион, цистеин, витамин K, аскорбиновую кислоту и др.).

Для понижения температуры замерзания и сохранения живых систем в условиях низких температур применяют защитные вещества - криопротекторы (глицерин, сахарозу, этиленгликоль и др.). Криопротекторы ослабляют эффект кристаллизации, изменяя её характер, препятствуют слипанию и денатурации макромолекул, способствуют сохранению целостности мембран клеток.

Замораживание.

1) Медленное охлаждение при -20 °С. Быстрое охлаждение не допускается по причинам, указанным выше.

2) Быстрое замораживание охлажденной среды в жидком азоте. Например, пробирка с охлажденной суспензией клеток на короткое время опускается в жидкий азот при температуре -196 °С. Медленное замораживание на этой стадии недопустимо, так как немногие возникшие в межклеточном пространстве центры кристаллизации растут, присоединяя воду из внутренних областей клеток. Клетки обезвоживаются, концентрация электролитов растет, что приводит к денатурации белков и гибели клетки. Кроме того, крупные кристаллы льда разрывают мембраны клеток и другие биологические структуры. При быстром замораживании по всему объему клетки образуется множество мелких кристаллов, и вода и электролиты фиксируются по месту их начального положения, не повреждая клеточных структур.

Размораживание.

3) Быстрое размораживание в теплой воде для исключения перекристаллизации и перераспределения электролитов.

4) Медленное нагревание, чтобы клетка могла адаптироваться и избежать температурного шока.

Технология замораживания живых клеток и тканей для хранения и последующей пересадки называется криоконсервированием. Эта многоступенчатая сложная технология замораживания и размораживания широко применяется в животноводстве и медицине для длительного хранения при низких температурах крови, тканей, органов и даже зародышей, а также спермиев и яйцеклеток человека и домашних животных, используемых для искусственного оплодотворения.

В природе происходит естественное криоконсервирование (без жидкого азота), когда при сезонном понижении температуры организм сам синтезирует необходимые для замораживания вещества.

Список литературы:

1. Белановский А.С., Журавлев А.И. и др. Основы физики и биофизики. - М.: Мир, 2008. - 384 с.
2. Лозина-Лозинский Л.К. Очерки по криобиологии. - Л.: Наука, 1972. - 288 с.
3. Цепкин Е. Как зимуют рыбы // Наука и жизнь. - 1999. - № 12. - С. 128.