ЛЕЧЕНИЕ И ПРОФИЛАКТИКА ВИЧ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИНСТРУМЕНТОВ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОМА

Вирус иммунодефицита человека (Human Immunodeficiency Virus - HIV) вызывает ВИЧ-инфекцию, заканчивающуюся развитием синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД, или от англ. AIDS - Acquired Immunodeficiency Syndrome). СПИД характеризуется преимущественным поражением иммунной системы, длительным течением, полиморфностью клинических проявлений, высокой летальностью, передачей в естественных условиях от больного человека здоровому (главным образом, при половых контактах или парентерально с инфицированными ВИЧ-материалами, от больной матери плоду, при грудном вскармливании) и склонен к быстрому эпидемическому распространению [2].

Возбудитель ВИЧ-инфекции - лимфотропный вирус, относящийся к семейству Retroviridae роду Lentivirus [2]. Вирус обладает лимфотропностью благодаря тому, что на Т-хелперах существуют в норме рецепторы CD4+ и CCR5, обеспечивающие проникновение вируса в клетку и его репродукцию в лимфоците [2].

Процесс слияния вириона с клеткой происходит при прикреплении вирусных белков gp120 и gp41 к CD4+ рецептору, а затем к CCR5 корецептору, что приводит к изменению конформации  пептидов слияния (fusion peptide), которые подобно штопорам ввинчивается в мембрану клетки, обеспечивая образование поры слияния (fusion pore) и проникновению генетического материала вириона в клетку [6].

Оказалось, что некоторые люди являются носителями мутации гена, которая предотвращает синтез СCR5 и, соответственно, их лимфоциты оказываются устойчивыми к заражению большинством вариантов ВИЧ [3].

Так, излечение от ВИЧ-инфекции наблюдалось при пересадке пациенту с острым лейкозом, красного костного мозга, в СКК которого имелась мутация гена, кодирующего белок CCR5 рецептора, что привело к невозможности прикрепления ВИЧ к CD4+ T-лимфоцитам [3].

Ключевой опасностью ВИЧ-инфекции является критическое снижение иммунного статуса личности и подверженность воздействию даже условно патогенных микроорганизмов. Особую опасность представляют облигатно патогенные возбудители заболеваний, например - Mycobacterium tuberculosis, возбудитель туберкулеза. Развитие данных оппортунистических инфекций ведет к явному снижению уровня жизни человека [5].

В настоящий момент в лечении ВИЧ используется антиретровирусная терапия с применением различных лекарственных препаратов - монотерапия (Ретровир), двойная (Вирамун, Ламивудин), и тройная (Калетра, Ламивудин, Никавир) [4]. Но их применение действенно скорее для профилактики вертикальной передачи ВИЧ-инфекции, нежели для её лечения, так как вирус всё ещё находится в Т-лифоцитах больного [5].

Однако, комбинация современных технологий, таких, как векторные Аденовирусы и Лентивирусы, плазмиды, способные переносить генетический код размером до 100 тысяч базовых пар - технология PiggyBac, редакторы генома - zinc-finger нуклеазы, TALEN и CRISPR / Cas9, позволили современным ученым создать эффективные инструменты редактирования генома клеток эукариот, и, в частности, клеток человека [6].

На данный момент CRISPR/Cas является самой совершенной технологией редактирования генома путем ДНК-интерференции и позаимствованной у бактерий, где та обеспечивала иммунитет против бактериофагов и плазмид. В отличие от своих предшественников - химерных нуклеаз, в CRISPR/Cas структурами, узнающими ДНК, являются не белки, а короткие РНК. Работа данного механизма обеспечивается специальными участками бактериального генома – локусами CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – сгруппированные короткие палиндромные повторы, с регулярными вставками спейсоров между ними). Как видно из названия, данный локус состоит из регулярных повторенных некодирующих последовательностей бактериальной ДНК, а разделяют эти повторы спейсеры – короткие фрагменты чужеродной (вирусной или плазмидной) ДНК. Профаги и плазмиды встраиваются в бактериальный геном после того, как ДНК бактериофага, попавшего в клетку бактерии, рекомбинирует с её геномом. Порядок и состав  расположения спейсеров является указателем числа атак, успешно пережитых самой бактериальной клеткой или её предками [1].

Разберем механизма работы CRISPR/Cas. При повторном проникновении в бактериальную клетку уже известного ей вируса, генетический код которого записан в спейсере, происходит синтез протяженной первичной РНК, закодированной в CRISPR-локусе. В результате созревания первичной ДНК образуется ряд коротких фрагментов (crRNA), каждый из которых состоит из специфического участка, соответствующего спейсеру, и универсальных участков, соответствующих палиндромным повторам бактериальной ДНК. Бактериальная ДНК также ответственна за привлечение уже упоминавшихся Cas-белков, а спейсер играет роль наводчика: он связывается с определенным, комплементарным ему участком вирусной ДНК, после чего белки Cas разрезают ее, обеспечивая элиминацию плазмиды или бактериофага. Благодаря высокой специфичности и способности к быстрой настройке система CRISPR/Cas9 работает очень эффективно, обеспечивая бактерии и её потомству надежную защиту от патогенов [1].

В настоящее время детально описаны несколько типов защитных систем CRISPR/Cas9. Наиболее успешной оказалась система CRISPR/Cas II-А, обнаруженная у бактерии Streptococcus pyogenes, состоящая из трех генов - кодирующих crRNA, трансактивирующую РНК (tracrRNA) и белок Cas9. На базе этой системы были созданы универсальные генетические конструкции, кодирующие элементы искусственного редактора генома CRISPR/Cas9 [1].

Также был создан упрощенный вариант системы, функционирующей в виде комплекса из белка Cas9 и единой направляющей РНК, которая представлена трансактивирующей CRISPR РНК и короткой зрелой crRNA. Направляющая последовательность опознает целевой участок ДНК и образует с ним комплементарные связи, а Сas9 – разрезает ДНК в месте, соответствующем спейсеру [1].

При помощи системы CRISPR/Cas9 можно осуществлять все виды модификаций генома: вносить точечные мутации, встраивать в определенные места новые гены, либо же, наоборот, удалять крупные участки нуклеотидных последовательностей, исправлять или заменять отдельные фрагменты генов.

Технология использования системы CRISPR/Cas9 включает в себя следующие этапы: выбор целевой последовательности и определение вида необходимого воздействия; создание ген-направленной конструкции и доставка её в клеточное ядро; анализ участка генома, подвергнутого воздействию [1].

Одним из перспективных направлений использования системы CRISPR/Cas9 может быть получение генетически модифицированных линий клеток - в клетки вводят вирусные векторы, которые обеспечивают высокий и устойчивый синтез элементов системы CRISPR/Cas9 [1].

Данный метод был применен группой китайских исследователей, которые поставили своей задачей изучить возможность излечения и профилактики ВИЧ-инфекции при помощи модификации генома CD4+ T-лимфоцитов путем вырезания участка, кодирующего рецептор CCR5, методом ДНК-интерференции при использовании системы CRISPR/Cas9, заключенной в плазмиду, созданную по технологии PiggyBac, которая, в свою очередь, является частью химерного Аденовируса (Ad5F35.Cas9) [7].

Особенностью системы PiggyBac является перенос большого для данного класса числа базовых пар - до 100 тысяч базовых пар, а так же вставка нужного элемента в геном таргетной клетки по принципу «вырезать - вставить», что проявляется в извлечении нужной нам последовательности из плазмиды и вставка данной последовательности в геном клетки. Процесс, при этом, полностью обратим и не оставляет вставленных ранее пар или же липких или тупых концов [6].

Только большой объем переносимой системой PiggyBac информации позволил поместить в неё систему CRISPR/Cas9, что вызывало затруднения ранее и сконструировать химерный аденовирус [6].

Использовалось множество вариантов спейсеров для системы CRISPR/Cas9 с целью выявить наиболее эффективный, который при этом бы не связывался с нецелевыми последовательностями и узнавал ген, даже при наличии в нем изменений. Ген, кодирующий CCR5 рецептор, располагается в коротком плече 3 хромосомы с 46 370 854 по 46 376 206 базовую пару [6].

Перед введением химерного вируса культура CD4+ Т-лимфоцитов была активирована Фитогемагглютинином, затем было произведено заражение вирусом. Контроль экспресии генов системы CRISPR/Cas9 проводился при помощи GFP - зеленого флюоресцирующего белка, по флюоресценции которого определяли число зараженных клеток при помощи метода цитометрии. Цитотоксический эффект при этом обнаружен не был [6].

Зараженные клетки проявляли пиковую активность в экспрессии белков системы CRISPR/Cas9 в разное время, но наибольшую - на 8 день с момента заражения [6].

При этом, при заражении модифицированной культуры CD4+ Т-лимфоцитов вирусом иммунодефицита человека было показано значительное снижения уровня пораженных данным вирусом клеток, которое зависело от выбранного для системы CRISPR/Cas9 спейсера - разные спейсеры имели различную эффективность в вырезании нужной последовательности [6].

Результаты данного эксперимента показывают его небывалую значимость в потенциальном лечении ВИЧ-инфекции, а соответственно и СПИДа, что позволило бы значительно улучшить состояние здоровья больных и сделать возможным излечение оппортунистических инфекций на фоне данного вторичного иммунодефицита, но клинические испытания осложняются множеством трудностей: таких, как запрет в ряде стран на модификацию генома человека в связи с недостаточной изученностью метода или опасностью удаления из генома человека нецелевых последовательностей; нужда в постоянном пополнении пула модифицированных CD4+ Т-лимфоцитов в крови, либо модификация стволовых клеток крови или же клеток лимфоидного ряда на уровне красного костного мозга, что так же сопровождается значительными трудностями.

В настоящий момент разрешение на проведение клинических испытаний по модификации генома человека полученного лишь врачами Китая, которые, возможно, станут первопроходцами в совершенно новой методике лечения самых различных заболеваний.

Список литературы:

1. Власов В. В., Медведев С. П., Закиян С. М. «Редакторы» Геномов. От цинковых пальцев до CRISPR // Наука из первых рук. — 2014. — № 2. [cyberleninka.ru] — Режим доступа. — URL:http://cyberleninka.ru/article/n/redaktory-genomov-ot-tsinkovyh-paltsev-do-crispr (дата обращения 15.10.2016)
2. Воробьев А. А. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учеб. пособие: М.: ООО «Медицинское информационное агенство», 2008. — 704 с.
3. Воронин Е. А. Устойчивые к ВИЧ // Наука из первых рук. — 2015. — №1. [cyberleninka.ru] — Режим доступа. — URL:http://cyberleninka.ru/article/n/ustoychivye-k-vich (дата обращения 18.10.2016)
4. Хвосторухина Н.Ф., Минасян А.М., Софьина А.В., Шляхова И.Ю., Яценко Д.С. Антиретровирусная терапия как метод профилактики вертикальной трансмиссии ВИЧ-Инфекции от матери ребенку // Фундаментальные исследования. — 2015. — №1. [cyberleninka.ru] — Режим доступа. — URL:http://cyberleninka.ru/article/n/antiretrovirusnaya-terapiya-kak-metod-profilaktiki-vertikalnoy-transmissii-vich-infektsii-ot-materi-rebenku (дата обращения 15.10.2016)
5. Хасанова Г. Р., Биккинина О. И., Акчурина Л. Б. Системный воспалительный ответ и прогрессирование ВИЧ-Иинфекции // Вестник современной клинической медицины. — 2013. — № 3. [cyberleninka.ru] — Режим доступа. — URL:http://cyberleninka.ru/article/n/sistemnyy-vospalitelnyy-otvet-i-progressirovanie-vich-infektsii (дата обращения 18.10.2016)
6. Chang Li, Xinmeng Guan, Tao Du, Wei Jin, Biao Wu, Yalan Liu, Ping Wang, Bodan Hu, George E. Griffin, Robin J. Shattock, Qinxue Hu. Inhibition of HIV-1 infection of primary CD4+ T-cells by gene editing of CCR5 using adenovirus-delivered CRISPR/Cas9. // Journal of General Virology. — 2015. — № 96. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed] — Режим доступа. — URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25854553 (дата обращения 10.10.2016)