ПРИМЕНЕНИЕ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МОНИТОРИНГЕ

APPLICATION OF CYTOGENETIC METHODS IN BIOLOGICAL MONITORING

Nikolay Knutarev

student, faculty of chemistry and biology, Orenburg State University,

Russia, Orenburg

Gelena Alekhina

scientific advisor, candidate of biological sciences, associate professor, department of biology and soil science, Orenburg State University,

Russia, Orenburg

АННОТАЦИЯ

В данной статье определяются возможности цитогенетических методов в системе экологического мониторинга по определению генотоксических агентов окружающей среды и демонстрируется их эффективность на примере ана-телофазного метода.

ABSTRACT

This article defines the capabilities of cytogenetic methods in the environmental monitoring system for the determination of genotoxic environmental agents and demonstrates their effectiveness using the ana-telophase method as an example.

Ключевые слова: экологический мониторинг, биоиндикация, биотестирование, цитогенетические методы, хромосомные аберрации, митоз.

Keywords: environmental monitoring, bioindication, biotesting, cytogenetic methods, chromosomal aberrations, mitosis.

В настоящее время большое значение придается биологическим методам, проводящим прямой анализ токсичности природных объектов с использованием различных чувствительных организмов растений и животных без адаптивных возможностей в качестве объектов биотестирования [2].

Биологический мониторинг абиотических и биотических компонентов окружающей природной среды является одним из ключевых элементов в системе обеспечения экологической безопасности территорий, подверженных воздействию опасных производственных объектов. Комплекс биологических исследований такой системы состоит из экотоксикологического мониторинга, а также мониторинга животного и растительного мира.

Экотоксикологический мониторинг включает изучение токсичности компонентов природной среды методами биотестирования на объектах, принадлежащих к разным системным группам (культуры клеток, микроорганизмы, низшие растения, беспозвоночные), исследования генотоксичности и мутагенности загрязненных компонентов природной среды (генетический мониторинг).

Мониторинг флоры и фауны включает изучение состояния растительных сообществ с использованием методов биоиндикации; изучение состояния репрезентативных видов высших животных по изменению их гематологических, биохимических и иммунологических показателей [1].

Помимо оценки токсических свойств загрязненных компонентов окружающей среды, данные биологического мониторинга используются для оценки эффективности сохранения биоразнообразия и характеристик экосистем, наряду с оценкой ущерба в чрезвычайных ситуациях, а также для принятия решений по ограничение воздействия какого-либо промышленного предприятия на окружающую среду.

Трансформация экологически опасных загрязнителей в окружающей среде приводит к образованию, как правило, более устойчивых и трудно идентифицируемых соединений. Малые и сверхмалые дозы этих веществ, безопасные с точки зрения санитарно-гигиенических норм, могут оказать существенное влияние на экосистемы. Эти вещества чрезвычайно сложно идентифицировать стандартными методами количественного химического анализа, но их действие можно обнаружить биологическими методами [6].

Наиболее значимыми последствиями воздействия экотоксикантов являются изменения генетического материала, которые возникают на самых ранних этапах развития ответной реакции организма. Они могут приводить к сильным нарушениям в биохимических и физиологических процессах, а также передаются следующим поколениям.

Выявлением генотоксических веществ и слежением за их мутагенной активностью посредством наблюдения за реакциями специальных биоиндикаторных видов занимается цитогенетический мониторинг. Анализируемые цитогенетические характеристики включают хромосомные аберрации, обмены сестринских хроматид, микроядра, ДНК-кометы и мейотические аномалии и в настоящее время используются для выявления воздействия различных антропогенных факторов (радиация, экотоксиканты и т. д.) на организм.

Преимуществом цитогенетических методов является их высокая чувствительность при оценке действия генетически активных факторов даже если они присутствуют в сверхмалых дозах. Для этого, как правило, используются организмы с низким и стабильно воспроизводящимся уровнем спонтанно возникающих генетических нарушений. Цитогенетические методы позволяют оценить напряженность окружающей среды на момент обследования, прогнозировать отдаленные последствия действия факторов окружающей среды на биоиндикаторный вид и экосистему в целом.

Наиболее удобными для цитогенетического мониторинга являются организмы с низкой индивидуальной вариабельностью анализируемых показателей и большим количеством делящихся клеток. Используемые тест-организмы и тест-системы должны отвечать ряду требований, из которых наиболее важными являются: - чувствительность к действующим факторам; - возможность получения данных и их корректной интерпритации применительно к поставленной задаче; - технологичность, т.е. быстрота и легкость проведения, тестов [5].

Не менее важна грамотная статистическая обработка полученных первичных данных. В первую очередь следует избегать каких-либо преобразований первичных данных, для чего наиболее удобным является использование непараметрических методов, например, критерий χ²(таблицы сопряженности), где первичные данные анализируются независимо от типа распределения изучаемой характеристики и не требуют каких-либо преобразований.

Первый необходимый этап анализа - проверка материала на однородность с помощью многопольных таблиц сопряженности. В дальнейшем этот же метод может быть использован для установления достоверности различий. Частоты встречаемости клеток, в частности, с хромосомными аберрациями, микроядрами и т. д. не должны рассматриваться как параметр нормального распределения и могут приводиться только как вспомогательные («для наглядности»). Наиболее корректно указывать доверительные интервалы для приводимых величин [3].

На данный момент наиболее распространенными являются методы учета патологий митоза – метафазный и ана-телофазный. Частота выявляемых ими спонтанных цитогенетических нарушений обычно невелика и колеблется от 0.5 до 3.5 %.

Метафазный метод более точен, однако и более трудоемкий, создает определенные ограничения при выборе тест-объектов – необходимы виды с небольшим числом крупных, хорошо идентифицируемых хромосом.

Точность ана-телофазного метода меньше (в 1.5 раз меньшее количество выявленных мутаций, позволяет выявить лишь некоторые хромосомные аберрации), однако использоваться в качестве тест-объекта может почти любая делящаяся клетка, поэтому он может считаться экспресс-методом и используется для предварительно оценки активности экотоксикантов. При этом для экологического мониторинга он является более предпочтительным, т.к. более простой и более быстрый, нежели метафазный.

Наглядно эффективность этих методов демонстрируется в исследованиях М. Ф. Козак и Н. В. Марченко в работе по анализу типов патологий митоза индуцированных водой рек дельты Волги в меристеме придаточных корней лука репчатого (Allium cepa L.) [4].

Цитологический анализ показал, что уровень патологий в анафазе митоза под воздействием вод рек дельты Волги превышал значения контрольных вариантов. При проращивании луковиц в воде рек Волга (июль), Ахтуба (июль, август) и Берекет (июль) корни не образовывались. Наибольшее генотоксическое воздействие оказывала вода из рек Царев, и Прямая Болда, вода из р. Волга (таблица 1). Доля клеток с хромосомными аберрациями в анафазе митоза под воздействием вод этих рек составила 31.3% и 36.0% соответственно.

Таблица 1.

Частота возникновения (%) хромосомных аберраций в анафазе митоза в клетках меристемы придаточных корней под воздействием загрязнения воды рек дельты Волги.

Примечание: # - при проращивании луковиц корни не образовывались

Наиболее часто встречались центрические и ацентрические фрагменты, хромосомные и хроматидные кольца, «забегание» и «отставание» хромосом, пульверизация всего хромосомного комплекса на фрагменты, трехполюсной митоз, полиплоидия (рисунок 1).

Рисунок 1. Патологический митоз в апикальной меристеме придаточных корней под воздействием загрязнения воды рек дельты Волги (полиплоидия слева, отставание хромосом справа)

Митотический индекс под влиянием загрязнения вод р. Волга в августе и ноябре составил 1,1% и 0,6% соответственно (при 2.6% в контрольной пробе). Наблюдалось увеличение числа клеток в профазе, что свидетельствует о повреждении генетического материала и неблагополучной экологической ситуации в регионе. Клетки в интерфазе имели гипертрофированные ядра, занимающие 90% пространства (рисунок 2). Длина корней, полученных при проращивании луковиц в пробах воды из реки Волги (август, ноябрь), оказалась значительно меньше, чем в контроле.

Рисунок 2. Результат генотоксического воздействие воды рек дельты Волги (гипертрофированные ядра слева, полиплоидия справа)

Таким образом загрязнение природной среды генотоксикантами оказывает достоверное мутагенное воздействие, вызывая образование хромосомных аберраций и других типов патологии митоза в клетках апикальной меристемы корней растений.

Учитывая, что давление, оказываемое средой на организм, будь то воздействие естественных факторов или антропогенных экотоксикантов, приводит к изменениям генетической информации, в подавляющем большинстве случаев негативного характера, сопровождающиеся серьезными нарушениями в жизнедеятельности организмов, цитогенетический мониторинг среды обязан присутствовать в системе экологического мониторинга.

Для мониторинга природных и искусственных объектов наряду с другими методами рекомендуется использовать цитогенетический анализ, дающий прямую оценку суммарного токсического и генотоксического загрязнения. Для повышения достоверности оценки воздействия мутагенов среды и исключения необъективных выводов на пролиферирующие клетки необходимо использовать одновременно несколько взаимодополняющих критериев.

Список литературы:

1. Artiola J. F., Brusseau M. L. The Role of Environmental Monitoring in Pollution Science // Environmental and Pollution Science (Third Edition). – Oxford: Academic Press, 2019. – C. 149 – 162.
2. Biobasics: bio-indicatorrs [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://web.archive.org/web/20111003162258/http://www.biobasics.gc.ca/english/View.asp?x=740 ( Дата обращения: 14.11.20).
3. Глотов, Н. В. Биометрия: учеб. пособие / Н. В. Глотов [и др.]. – Москва: Регулярная и хаотическая динамика, 2005. – 381 с.
4. Козак, М. Ф. Цитогенетические эффекты воздействия антропогенного загрязнения вод нижней волги: монография / М. Ф. Козак, Н. В. Марченко. – Астрахань: Астраханский университет, 2008. – 116 с.
5. Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ. – Москва: Медицина, 1989. – 211 с.
6. Хотько Н. И., Дмитриев А. П. Биомониторинг окружающей среды в районах размещения опасных промышленных объектов. Теория и практика / Н. И. Хотько, А. П. Дмитриев. – Саратов: ГосНИИЭНП, 2015. – 184 с.