ДИНАМИКА НАКОПЛЕНИЯ САПОНИНОВ КАЛЛУСНЫМИ КУЛЬТУРАМИ Trigonella foenum-graecum

Глушакова Дарья Юрьевна

студент 4 курса, кафедра физиологии и биохимии растений БГУ, г. Минск

Е-mail: dasha.glushakova@gmail.com

Логвина Анна Олеговна

научный руководитель, ассистент кафедры физиологии и биохимии растений БГУ, г. Минск

Важным направлением биотехнологии, которое успешно и интенсивно разрабатывается в последнее время, является изучение способности растительных клеток и тканей in vitro к синтезу веществ вторичного происхождения. Культуры клеток и тканей способны синтезировать вещества высокой биологической активности, что позволяет использовать эти объекты в качестве сырья для фармацевтической промышленности [1, с. 34]. При этом целесообразность инициирования и дальнейшего использования клеточных культур в подобных производствах определяется многими условиями. Важнейшим из них является правильный выбор растительного объекта, так как клеточные культуры, наследуя генетическую информацию исходного растения, приобретают и его способность синтезировать вторичные метаболиты [2, с. 234]. Поэтому, как правило, выбор исследователей падает на растения, обладающие какими-либо уникальными биосинтетическими свойствами. Одним из таких растений является пажитник греческий (Trigonella foenum-graecum L.). Его уникальность определяется способностью синтезировать сапонины ― вещества, наличие которых обуславливает такие важные с точки зрения современной медицины свойства, как противораковая [5, с. 1394] и противодиабетическая активности [4, с. 56].

Важным этапом исследования клеточных культур является изучение интенсивности биосинтетических процессов в отношении биологически активных веществ на разных стадиях ростового цикла.

В связи с этим целью данной работы было изучение динамики накопления сапонинов каллусами Trigonella foenum-graecum в процессе их роста.

Объектами изучения служили каллусы стеблевого и листового происхождения пажитника греческого ярового сорта Ovari 4, полученные на базе кафедры физиологии и биохимии растений Белорусского государственного университета в ноябре 2009 г. Культивирование каллусов осуществляли в темноте в условиях микробиологического термостата при температуре 24,5°С на агаризованных питательных средах, состав которых был оптимизирован на первых этапах исследования [7, с. 32]. Минеральная основа питательного раствора соответствовала среде Мурасиге и Скуга (МС) [8, с. 481]. Источником углерода служила сахароза в концентрации 40 г/л. Среды МС дополняли регуляторами роста 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (2,4-Д), кинетином, индолил-3-уксусной кислотой (ИУК) в следующих концентрациях: 2,0 мг/л 2,4-Д, 2,0 мг/л кинетина, 2,0 мг/л ИУК для листового каллуса; 1,0 мг/л 2,4-Д, 1,0 мг/л кинетина, 2,0 мг/л ИУК для стеблевого каллуса. Было показано, что ростовые кривые исследуемых каллусных культур имели стандартную S-образную форму [3, с. 25].

Общее содержание сапонинов в 30 %-х водно-спиртовых экстрактах определяли с использованием спектрофотометрической методики, описанной Hiai et al. (1976) [5, с. 119], на 5-е, 10-е, 15-е, 20-е, 25-е, 29-е, 32-е, 35-е и 40-е сут культивирования.

Из данных, представленных на рис. 1, видно, что листовой каллус пажитника греческого ярового сорта демонстрировал наиболее высокую биосинтетическую способность в отношении сапонинов на ранних стадиях роста. Максимальное содержание наблюдалось на 5―10 сут культивирования, соответствующие лаг-фазе ростового цикла, и составляло 113 мг/г сухой массы. В дальнейшем при переходе клеток к активному росту происходило постепенное снижение интенсивности накопления стероидных сапонинов, так что минимум пришелся на 25 сут, что соответствует экспоненциальной фазе, и составил всего 44 мг/г сухого вещества, что более чем в 2 раза ниже по сравнению с изначальным уровнем сапонинов. Начиная с 29 сут ростового цикла (фаза замедления роста) общее содержание сапонинов в каллусной ткани стало увеличиваться и на 35 сут (стационарная фаза роста) составляло уже 91 мг/г сухой массы. Однако дальнейшее культивирование каллусов привело к снижению уровня сапонинов до 68 мг/г сухой массы.

Рисунок 1. Динамика накопления сапонинов листовым каллусом пажитника греческого.

Фазы роста: 1 ― латентная; 2 ― логарифмическая; 3 ― замедления роста; 4 ― стационарная.

В процессе изучения динамики накопления сапонинов каллусом стеблевого происхождения была выявлена та же закономерность, что и для листовой культуры (рис. 2). Так, во время латентной фазы роста (до 10-х сут) интенсивность синтеза сапонинов каллусной тканью была высокой: общее содержание сапонинов составляло 100 мг/г на 5 сут и 88 мг/г на 10 сут, однако достоверных различий между данными значениями обнаружено не было. Начиная с 15 сут. наблюдалось резкое снижение биосинтеза стероидных сапонинов, так что минимум пришёлся на середину экспоненциальной стадии ростового цикла (20 сут). В данной точке ростовой кривой содержание сапонинов составляло всего 20,96 мг/г, что почти в 5 раз ниже по сравнению с 5 сут культивирования. Однако замедление ростовых процессов каллуса (29 сут) сопровождалось скачкообразным повышением его биосинтетической активности в отношении данных метаболитов и общее содержание сапонинов достигло максимума, что составило 123,42 мг/г сухой массы. В ходе стационарной фазы ростового цикла (32―35 сут) несмотря на небольшое снижение интенсивности накопления сапонинов, все же их уровень оставался довольно высоким. Как и в случае каллуса листового типа к 40-м сут наблюдалось снижение уровня сапонинов в клетках.

Рисунок 2. Динамика накопления сапонинов стеблевым каллусом пажитника греческого.

Фазы роста: 1 ― латентная; 2 ― логарифмическая; 3 ― замедления роста; 4 ― стационарная.

Таким образом, проведенные исследования позволили установить, что особенностью биосинтеза сапонинов каллусами пажитника греческого в процессе их роста является наличие двух максимумов накопления данных вторичных метаболитов. На начальных этапах роста (лаг-фаза и начальная лог-фаза) каллусы Trigonella foenum-graecum характеризовались высоким уровнем сапонинов. Во время активного роста клеточных культур (середина лог-фазы ростового цикла) наблюдалось снижение активности биосинтетических процессов. Переход клеточных культур пажитника греческого к стационарной фазе роста сопровождался значительной стимуляцией образования сапонинов. Также сравнительный анализ содержания сапонинов в клеточных культурах во время стационарной фазы роста показал, что биосинтетический потенциал каллуса стеблевого происхождения в отношении данных метаболитов выше по сравнению с листовой культурой.

Список литературы:

1.Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе: учеб. пособие. М.: ФБК-Пресс, 1999. ― 160 с.

2.Воллосович А.Г. Культура изолированных тканей и клеток растений. М.: Наука, 1970. ― 234―235 с.

3.Логвина А.О., Юрин В.М. Изучение динамики роста каллусных культур пажитника греческого / А.О. Логвина // Труды Белорусского государственного университета. Серия «Физиологические, биохимические и молекулярные основы функционирования биосистем». ― 2011. ― Том 6. (в печати)

4.Gopalan C., Ramasastri BV., Balasubramanian SC. Nutritive value of Indian food // Hyderabad: National institute of nutrition, Indian council of medical research. ― 1998. ― Vol. 1. ― P. 47―91.

5.Hiai S., Oura H., Nakajima T. Color reaction of some sapogenins and saponins with vanillin sulfuric acid. Planta Med. ― 1976. ― Vol. 29. ― P. 116―122.

6.Jayadev R., Jagan M.R. Patlolla, Malisetty V. Swamy, Chinthalapally V. Rao. Diosgenin, a Steroid Saponin of Trigonella foenum-graecum (Fenugreek), Inhibits Azoxymethane-Induced Aberrant Crypt Foci Formation in F344 Rats and Induces Apoptosis in HT-29 Human Colon Cancer Cells // Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention. ― 2004. ― Vol. 13. ― P. 1392―1398.

7.Lohvina H.O., Makai S., Ditchenko T.I., Reshetnikov V.N., Spiridovich E.V., Yurin V.M. Induction of callus from leaves and stems of Trigonella foenum-graecum varieties // Acta Agronomica Óváriensis. ― 2012. ― Vol. 24 (2). ― P. 29―37.

8.Murashige T., Skoog T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. ― 1968. ― Vol. 15 (13). ― P. 473―497.