ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ LUX-БИОСЕНСОРОВ ДЕТЕКТИРОВАТЬ ГЕНОТОКСИЧНОСТЬ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ВОДОПРОВОДНОЙ ВОДЫ Г. ГРОЗНОГО

Одной из главных задач гигиены окружающей среды в условиях быстрого загрязнения биосферы антропогенными факторами различной природы является предупреждение его генетических последствий, т.е. урона для здоровья настоящего и будущих поколений людей, обусловленного воздействием факторов окружающей среды на наследственность. Проблема загрязнения окружающей среды соединениями, представляющими опасность для здоровья человека, является наиболее актуальной. Известно, что опасность для здоровья представляют соединения, обладающие способностью вызывать отдаленные эффекты: мутагены, канцерогены. В большинстве случаев на мутагенность исследуются отдельные химические соединения [4]. Однако, в природе на живой организм чаще действуют не индивидуальные соединения, а целый комплекс. В природных объектах, таких как вода, почва, воздух, отдельные химические соединения, относящиеся к различных классам, влияя друг на друга, иногда усиливают мутагенный потенциал [6]. На сегодняшний день известно много физических и биологических факторов, тысячи химических веществ, обладающих свойством вызывать мутации. В последние десятилетия вопросы, связанные с механизмом и специфичностью действия мутагенов, приобрели еще один весьма значительный аспект. Появилась проблема, связанная с загрязнением окружающей среды мутагенами, выбрасываемыми в окружающую среду в результате хозяйственной деятельности человека, а также влиянием их на наследственность как человека, так и всего живого на Земле. Исследования в этой области обоснованы опасением ученых за здоровье настоящего и будущих поколений, за судьбы существующих генофондов.

В генетической токсикологии для определения и оценки мутагенной активности химических факторов внешней среды принят поэтапный подход [1]. На этапе первичной оценки мутагенной активности химических соединений чаще всего применяют тест Эймса Salmonella/микросомы [2, 3]. Для регистрации мутагенной активности в данном тесте используется набор штаммов S. typhimurium, ауксотрофных по гистидину и ревертирующих к дикому типу в результате индукции обратных мутаций, который может быть использован при оценке мутагенной активности конкретного исследуемого соединения, однако не совсем подходит для скрининга большого числа химических соединений в связи с большим объемом работы, несоизмеримым с объемом получаемой при этом информации. Для решения этой проблемы был предложен метод регистрации индукции SOS-ответа в клетках Е. coli, получивший название «SOS-хромотест» [5]. Несмотря на то что SOS-хромотест позволяет регистрировать активность генотоксичных соединений, включая перекиси. К числу таких агентов относятся некоторые соединения металлов [8, 9], наночастицы [10, 11], прооксиданты и другие индукторы окислительного стресса [12, 13].

Тестирование химических соединений на их способность индуцировать окислительный стресс в клетках стало возможным благодаря штаммам E. coli, содержащим плазмиду, в которую встроена генетическая конструкция с различными индуцируемыми промоторами, слитыми с lux генами светящихся бактерий в качестве генов-репортеров. Такие штаммы, получившие название lux-биосенсоров предложены для обнаружения в компонентах окружающей среды тяжелых металлов [14], антибиотиков [15], токсичных и генотоксичных соединений [16, 17].

Целью настоящей работы является изучение возможности набора из трех lux-биосенсоров детектировать генотоксичность различных биологически активных химических соединений водопроводной воды г. Грозного по способности индуцировать окислительный стресс и SOS-ответ в клетках E. coli.

Для работы были использованы 3 lux-биосенсора на основе штамма E. Coli K12: MG1655 (pSoxS–lux), MG1655 (pKatG–lux) и MG1655 (pRecA–lux), несущие рекомбинантную плазмиду с lux-опероном люминесцирующей бактерии Photorhabdus luminescens, слитым с промоторами генов супероксиддисмутазы SoxS, каталазы KatG и SOS-промотором PrecA.

Штаммы E. coli, несущие lux-оперон, под воздействием индукторов окислительного стресса или ДНК-повреждающих агентов начинают активно продуцировать люциферин-люциферазный комплекс, что приводит к повышению уровня биолюминесценции.

Штаммы lux-биосенсоров любезно предоставлены проф. Чистяковым В.А., зав. лаборатории экспериментального мутагенеза НИИ Биологии ЮФУ. Их генотипы и описание конструкций, несущих ими рекомбинантных плазмид приведены в работах [15; 17].

Для оценки генотоксических характеристик водопроводной воды г. Грозного были отобраны пробы воды в Старопромысловском (ул. Заветы Ильича, ул. Кутайсская), Ленинском (ул. Полярников, ул. Чайковского), Октябрьском (ул. Сайханова, ул. 8 марта), Заводском (ул. Мамсурова, ул. Выборгская) районах. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Бактерии lux-биосенсоров культивировали до логарифмической фазы (ночная культура) в бульоне Луриа-Бертана (LB), содержащем 100 мкг/мл ампициллина. Ночную культуру разводили до концентрации 10⁷ кл/мл в свежем бульоне и растили при 37°С 2-3 ч. Затем культуры по 90 мкл вносили в лунки 96-луночного планшета и добавляли 10 мкл пробами воды. В качестве позитивных контролей для индукции SOS-ответа в клетках Е.coli MG1655 (pRecA-lux) использован антибактериальный диоксидин (2,25*10^-5 M). Для индукции окислительного стресса в штаммах E. coli MG1655 (pKat–lux) и Е.coli MG1655 (pSoxS–lux) использованы соответственно перекись водорода (10^-3 M) и паракват (10^-3 M). В качестве отрицательного контроля использована дистиллированная вода.

Интенсивность биолюминесценции измеряли на микропланшетном люминометре Luminometer photometer LM 01A. После добавления проб воды в культуры проводили инкубацию при 37°С в течение 90 минут. После измерения на люминометре из полученных данных вычисляли фактор индукции по формуле:

R = I_ind /I₀,

где I₀ - уровень спонтанной люминесценции культуры (в отсутствие индуктора), I_ind - уровень люминесценции в присутствии исследуемого препарата.

Результаты проведенного исследования представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Биолюминесцентный отклик lux-биосенсоров в присутствие проб водопроводной воды г. Грозного

Как видно из табл. 1 при отклике штамма Е.coli MG1655 (pRecA-lux) в присутствие водопроводной воды г. Грозного во всех пробах наблюдалось повышение уровня биолюминесценции в среднем на 24,1 % относительно негативного контроля (дистиллированная вода), что говорит о проявлении генотоксических свойств воды. При отклике штамма Е.coli MG1655 (pSoxS–lux) в присутствии проб воды № 1, 2, 3, 7, 8 (табл.1) наблюдалось повышение уровня свечения в среднем на 13 % и понижение уровня люминесценции в среднем на 8,3 % у проб № 4, 5, 6 в сравнении с отрицательным контролем. У штамма E. coli MG1655 (pKat–lux) (табл.1) отмечено понижение уровня люминесценции в пробах № 4-8 в среднем на 6,8 % и незначительное повышение в среднем на 1,3 % в пробах № 1-3. Понижение уровня биолюминесценции может быть вызвано в следствие подавления роста бактерий. Как известно хлорирование повышает мутагенный потенциал воды [7], о чем свидетельствует отклик штамма Е.coli MG1655 (pRecA-lux) реагирующего на ДНК-тропное воздействие.

Исходя из вышесказанного, можно предположить, что в результате хлорирования генотоксические характеристики водопроводной воды повысились, что привело к индукции окислительного стресса в клетках E.coli, следствием чего явилось ДНК-тропное воздействие. Тем самым, объясняется подавление роста микроорганизмов в некоторых пробах.

Таким образом, водопроводная вода г. Грозного обладает генотоксическими свойствами индуцируя окислительный стресс и SOS-ответ в клетках E.coli.

Список литературы:

1. Абилев С.К., Глазер В.М. Генетическая токсикология: Итоги и проблемы //Генетика. – 2013. – Т. 49(1). – С. 81–93. doi: 10.7868/ S001667581301 0025.
2. Ames BN, Durston WE, Yamasaki E, Lee FD. Carcinogens are mutagens: a simple test system combining liver homogenates for activation and bacteria for detection. //Proc Natl Acad Sci USA. 1973a. - №70(8). - Р.2281-2285. doi: 10.1073/pnas.70.8.2281.
3. Ames BN, Lee FD, Durston WE. An improved bacterial test system for the detection and classification of mutagens and carcinogens. //Proc Natl Acad Sci USA. 1973b. - №70(3). – Р.782-786. doi: 10.1073/pnas.70.3.782.
4. Ames B.N., Lee F.D., Durston W.E. An improved bacterial test system for detection and classification of mutagens and carcinogens //Prod. Nac. Akad. Sci. USA, 1973. -V. 70. -№23. -Р. 782.
5. Quillardet P, Huisman O, D’Ari R, et al. SOS chromotest, a direct assay of induction of an SOS function in Escherichia coli K12 to measure genotoxity. //Proc Natl Acad.Sci USA, 1982. - № 79(19). – Р. 5971-5975. doi: 10.1073/ pnas.79.19.5971.
6. Saffiotti V. Evolution of mixed exposure to carcinogens and correlation of in vivo and in vitro systems // Environ. Health. Perspect., 1983. -V.47.- Р.319-324.
7. Круглова З.Ф. Генотоксический потенциал сточных вод и осадков как составная часть их токсикологической характеристики: дис. на соиск. учен. степ. к.б.н. (03.00.07) /Круглова Зульфия Фенуновна; Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина. – Казань, 2002. – 110 с.
8. Реутова Н.В. Мутагенный потенциал тяжелых металлов // Экологическая генетика. – 2015. – Т. 13. – Вып. 3. – С. 70–75. doi: 10.17816/ecogen13370-75.
9. Valko M, Morris H, Cronin MT. Metals, toxicity and oxidative stress. //Curr Med Chem. 2005. - №12(10). – Р.161-1208. doi: 10.2174/0929867053764635.
10. Сычева Л.П. Оценка мутагенных свойств наноматериалов // Гигиена и санитария. – 2008. – № 6. – С. 26–28.
11. Ghosh M, Manivannan J, Sinha S, et al. In vitro and in vivo genotoxicity of silver nanoparticles. //Mutat Res. 2012. - №749(1-2). – Р.60-69. doi: 10.1016 /j.mrgentox.2012.08.007.
12. Манухов И.В., Котова В.Ю., Мальдов Д.Г., и др. Индукция окислительного стресса и SOS-ответа в бактериях Escherichia coli растительными экстрактами: роль гидроперекисей и эффект синергизма при совместном действии с цисплатиной // Микробиология. – 2008. – Т. 77. – С. 590–597. doi: 10.1134/S0026261708050020.
13. Котова В.Ю., Манухов И.В., Завильгельский Г.Б. Lux-биосенсоры для детекции SOS-ответа, теплового шока и окислительного стресса // Биотехнология. – 2009. – № 6. – С. 16–25. doi: 10.1134/ S0003683810080089.
14. Завильгельский Г.Б., Котова В.Ю., Хрульнова С.А., Манухов И.В. Оценка токсического действия наноматериалов на живые организмы // Биотехнология. – 2013. – № 6. – С. 8–17.
15. Котова В.Ю., Рыженкова К.В., Манухов И.В., Завигельский Г.Б. Индуцируемые специфические lux-биосенсоры для детекции антибиотиков: конструирование и основные характеристики //Прикладная биохимия и микробиология. – 2014. – Т.50. – №1. – С. 112–117. doi: 10.7868/ S0555109 914010073.
16. Сазыкина М.А., Чистяков В.А. Мониторинг генотоксичности водной среды: Азово-Донской бассейн: Монография. – Ростов н/Д: Изд-во ЮФУ, 2009. – 183 с.
17. Vollmer CA, Van Dyk TK. Stress responsive bacteria biosensors as environmental monitors. //Adv Microb Physiol., 2004. – №49. – Р. 131-174. doi: 10.1016/S0065-2911(04)