ГЕНЫ РЕПАРАЦИИ ДНК: ЧАСТОТА ГЕНОТИПОВ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ XRCC1 (rs25487, rs1799782) И XRCC4 (rs1805377, rs2075685)

Одним из факторов, лежащих в основе возникновения повреждений структуры генетического материала является действие генотоксикантов, перечень которых постоянно пополняется. Они есть среди лекарственных препаратов, косметических средств, в бытовой химии, химических продуктах, продуктах переработки нефти. Очевидно, что на территориях с повышенным уровнем загрязнения, в частности, в регионах с развитой нефтяной промышленностью частота регистрируемых мутаций будет значительно выше, чем в целом в популяции. В частности, зону риска образует Чеченская республика из-за высокого содержания в почве продуктов нефтепереработки и подземных нефтяных «ям» вследствие утечки нефти в результате аварий, техногенных катастроф, которые «питают» подземные воды [2].

Генотоксичные соединения путем ингибирования систем репарации, усиления апоптоза, активации окислительного стресса способствуют возникновению соматических мутаций в клетках, запуская в них процессы злокачественной трансформации, и являются одной из причин распространенности и роста мультифакториальных заболеваний [6, 8, 12, 15].

Большинство возникающих ошибок активируют соответствующие механизмы репарации ДНК, который представляет собой сложный комплекс взаимосвязанных ферментов. При этом информацию о структуре ферментов, осуществляющих репарацию, несет в себе сама молекула ДНК. Ферменты четко определяют нормальную структуру матричных молекул, поэтому большинство изменений в строении ДНК, как правило, не читаются ферментами ДНК- и РНК-полимеразами, блокируют транскрипцию и репликацию, то есть. Благодаря наличию полиморфизмов в генах, кодирующих репаративные белки, система репарации ДНК определяет индивидуальные различия организма в ответной реакции на действие генотоксичных соединений. Полиморфные варианты генов ведут к изменениям в слаженной работе комплекса ферментов, вследствие изменения их структуры, что, в свою очередь, угнетает процессы репарации ДНК, инициируя более тяжелые нарушения в работе клеточных систем и в целом, в организме, способствуя развитию заболеваний мультифакторной природы [14, 7]. Очевидно, что изучение полиморфизмов генов системы репарации ДНК является важной составляющей в определении индивидуальной чувствительности организма на загрязнение окружающей среды и позволяет выделить группы риска с целью проведения профилактических мероприятий. В связи с этим, целью настоящего исследования явилось определение частоты генотипов полиморфных вариантов генов системы репарации ДНК: XRCC1 (G1996A, C589T) и XRCC4 (G245A, G1924T).

Материал и методы исследования.

Материалом для изучения полиморфных вариантов генов репарации ДНК явилась геномная ДНК, выделенная из образцов цельной крови, собранной у здоровых добровольцев (n=342).

Для определения генотипов нами была использована тетрапраймерная ПЦР с использованием двух пар аллель-специфичных праймеров, позволяющая в одной реакции определить тип генотипа по изучаемому полиморфизму. Для детекции продуктов полимеразно-цепной реакции проводили горизонтальный электрофорез в 2 % агарозном геле, с добавлением в качестве красителя этидия. Для определения длин фрагментов полученных ампликонов в одну из лунок приготовленной гелевой пластинки добавляли маркер M50. Визуализацию осуществляли в проходящем ультрафиолетовом свете.

Результаты и обсуждение.

В данной работе нами изучена частота генотипов по полиморфным вариантам Arg399Gln и Arg194Trp гена XRCC1 и G245A и 1394 XRCC4 Характеристика исследованных полиморфизмов и их значения приведена в таблице 1.

Таблица 1.

Характеристика полиморфных вариантов гена XRCC1и XRCC4

Ген XRCC1 является важным звеном в механизме исправления ошибок - эксцизионной репарации оснований (base excision repair, BER), при которой поврежденное азотистое основание, например тиминовый гликоль, удаляется специфической ДНК-гликозилазой до вскрытия сахарофосфатного каркаса ДНК.

Наиболее изученный полиморфизм гена XRCC1 располагается в 399 кодоне около COOH белкового конца, в сайте взаимодействия XRCC1 с поли(ADP-рибоза) полимеразой. Однонуклеотидный полиморфизм гена XRCC1 Arg399Gln определяет замену аминокислоты аргинин на глицин в структуре кодируемого белка, вследствие чего снижается его активность [3]. Данную мутацию в гене XRCC1 связывают с повышенным риском развития злокачественной трансформации клеток, в том числе образования рака легкого, рака желудка, лимфом [4, 13]. В ряде работ отмечается связь между полиморфизмом Arg399Gln с развитием лимфопролиферативных опухолей и острого лимфобластного лейкоза [1, 5]

Результаты типирования полиморфных вариантов гена XRCC1 представлены в таблице 2.

Таблица 2

Результаты типирования полиморфных вариантов гена XRCC1(Arg399Gln) и XRCC1(Arg194Trp)

Распределение частоты генотипов XRCC1 соотвествует равновесию Харди-Вайнберга (табл. 2). Анализ полученных данных показывает различный характер распределения генотипов по полиморфным вариантам Arg399Gln и Arg194Trp гена XRCC1. Для замены аргинина на глицин в 399 положении (аллель G) - отмечается высокая частота гетерозиготного носительства (48, 42%). Гомозиготы по аллелю G определяются более чем в два раза чаще по сравнению с гомозиготными генотипами по аллелю A 35,76 против 15,82 %. Предположительно, отбор по полиморфному варианту Arg399Gln гена XRCC1 шел в сторону гетерозигот и рецессивных гомозигот, обеспечивающих более высокие адаптивные возможности организма. В тоже время минорный аллель T другого изученного полиморфного варианта C589T (Arg194Trp) отличается низкой частотой и в гомозиготе практически не обнаруживается, а частота гетерозиготного носительства составляет всего 9, 66 %. Вероятно, это объясняется серьезными нарушениями, вызываемыми данным вариантом в гомозиготном состоянии и потому элиминирующихся естественным отбором из популяции.

Анализ распределения генотипов показал, что в 19 случаях отмечается одновременное носительство минорных аллелей обеих полиморфизмов в гетерозиготном варианте, в тоже время как вариант гомозиготного генотипа по аллелю A AA и гетерозиготный генотип CT встречается только в одном случае. Полагаем, что это может служить основанием для включения данных индивидов в группу риска для более тщательного наблюдения.

Реструктурирующий кросс-комплементарный белок 4, кодируемый геном XRCC4 является одним из нескольких основных белков, участвующих в пути не гомологичного концевого соединения для восстановления разрывов двойной цепи ДНК. Ген XRCC4 человека содержит восемь экзонов и определяет три варианта транскрипции мРНК, которые кодируют две различные изоформы белка. Недавние исследования показали связь носителей полиморфных вариантов гена XRCC4 с восприимчивостью к различным патологиям. Ассоциативные исследования роли гена XRCC4 в генезе злокачественных новообразованиям демонстрируют роль мутаций гена в восприимчивости  к раку поджелудочной железы [16, 11, 10]. Есть данные, отмечающие значимые ассоциации между носителями мутацией XRCC4 и эндометриозом.

Нами изучено два наиболее функционально значимых полиморфных варианта гена XRCC4: G1394T (rs2075685) и G245A (rs1805377) (таблица 3). Тест на соответствие выборки равновесию Харди – Вайнберга показал соответствие по генотипам XRCC4 (rs2075685), по полиморфизму XRCC4 (rs1805377) не дотягивает до равновесности. Наиболее частым из трех представленных генотипов по полиморфному варианту rs2075685 оказался гетерозиготный генотип. Его частота составила 50%. Частота гомозиготного по аллелю1394T генотипа незначительно превышала таковую по аллелю G1394: 29,17% против 20,83 %.

При сравнении с данными международного проекта HapMap оказалось, что частота генотипов, определенная для полиморфизма rs2075685 в настоящем исследовании сопоставима с аналогичными показателями для европейских популяций. Генотипы по второму полиморфному варианту гена XRCC4 распределились в изученной выборке следующим образом: частота гетерозиготного генотипа составила 52,5 %, в 35,0% случаев отмечался гомозиготный по мажорному аллелю генотип и только у 12,5 % респондентов оказался генотип гомозиготный по минорному аллелю. Интересно, что оба полиморфизма чаще обнаруживаются в гетерозиготном, чем в гомозиготном состоянии. Скорее всего, это объясняется сложным характером взаимодействия множества генов, полиморфные варианты которых в совокупности определяют характер протекания реакций для нормальной жизнедеятельности организма в тех или других условиях.

Таким образом, нами в настоящей работе определено, что частота полиморфных вариантов генов репарации XRCC1 и XRCC4 в целом соответствует общеевропейским показателям (табл.3).

Таблица 3

Результаты типирования полиморфных вариантов гена XRCC4 (rs2075685) и XRCC4 (rs1805377)

Механизм, предназначенный для репарации, эволюционировал вместе с организмами и становился все более сложным, частично из-за появления новых вариантов, которые должны были способствовать большей надежности и точности этого механизма. Точность репликации ДНК очень велика, частота ошибочных включений нуклеотидов не превышает 10⁹-10¹⁰ на нуклеотид за один раунд репликации [9]. Такая точность копирования достигается благодаря двойному контролю со стороны ДНК-полимераз, участвующих в репликативном синтезе ДНК, обладающих контрольными и корректорскими функциями. Понятно, что нарушение самого процесса репарации, может провоцировать серьезные проблемы в процессах клеточного метаболизма, в результате которых возникают риски развития заболеваний с наследственной предрасположенностью. Знание механизмов, приводящих к различным заболеваниям, крайне необходимо для разработки профилактических мероприятий и индивидуального подхода в лечении мультифакторных патологий.

Список литературы:

1. Воропаева Е.Н. Ассоциация полиморфизма Arg399Gln гена репарации ДНК XRCC1 с риском развития неходжкинских лимфом высокой степени злокачественности /Е.Н. Воропаева, Т.И. Поспелова, М.И. Воевода //Гематология и трансфузиология, 2013. - №1 – С. 4-6.
2. Гайрабеков У.Т. Основные этапы развития и воздействия нефтепромышленного производства на ландшафтную среду Чеченской республики // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 2-2.
3. Государственный доклад «О состоянии природных ресурсов и окружающей среды Республики Башкортостан в 2012 году». ‒ Уфа, 2013. ‒ 319 с.
4. Измайлов А.А. Молекулярно-генетические маркеры прогноза при поверхностном раке мочевого пузыря /А.А. Измайлов [и др.] //Медицинский вестник Башкортостана. ‒ 2011. ‒ Т. 6, № 5. ‒ С. 47-51.
5. Ракитин С.С.  Полиморфизм генов репарации ДНК XRCC1 280, XRCC1 194, XRCC1 339 и XPD 751 при раке желудка. /С.С.Ракитин, А.И. Дмитриева, В.В.Новицкий, И.А.Кузнецова, В.А.Авхименко //Бюллетень сибирской медицины, 2011. №6 – С. 35-39
6. Akhmadishinaa L.Z.  DNA Repair XPCC1 and XPD Genes Polymorphism as Associated with the Development of Bladder Cancer and Renal Cell Carcinoma / L.Z. Akhmadishinaa [et. all] // Russian journal of genetics. – 2014. ‒ Vol. 50, №. 4. ‒ Р. 481-490.
7. Bănescu, C. Polymorphism of XRCC1, XRCC3, and XPD Genes and Risk of Chronic Myeloid Leukemia / C. Bănescu [et al.] // Biomed Res Int. ‒ 2014. ‒ Vol. 2014. – Р. 9.
8. Catana, A. Genetic polymorphism of DNA repair gene ERCC2/XPD (Arg 156 Arg) (A22541C) and lung cancer risk in Northern Romania / A.Catana [et al.] // Revista Română de Medicină de Laborator. ‒ 2012. ‒ Vol. 20, № 2. – P. 157-161.
9. Cox EC. Bacterial mutator genes and the control of spontaneous mutation. Annu Rev Genet. 1976;10:135–156.
10. Ding Y., Li L.N. XRCC4 rs2075685 polymorphism could influence the susceptibility to pancreatic cancer in a Chinese population. /Y. Ding, L.N. Li //Genetics and Molecular Research, 2015. - № 14 (3). – Р. 9626-9632
11. Guo, H Polymorphisms in DNA repair genes, hair dye use, and the risk of non-Hodgkin lymphoma. / H Guo, BA Bassig, Q Lan, Y Zhu, Y Zhang, TR Holford, B Leaderer, P Boyle, Q Qin, C Zhu, N Li, N Rothman, T. Zheng //Cancer Causes Control., 2014. - №10. – Р.1261-70
12. Huang, Z.H. Polymorphisms in p53, GSTP1 and XRCC1 predict relapse and survival of gastric cancer patients treated with oxaliplatin– based adjuvant chemotherapy / Z.H. Huang, D.Hua, X. Du // Cancer Chemother Pharmacol. – 2009. ‒ Vol. 64, № 5. ‒ P. 1001-1007.
13. Jiang Z. A meta-analysis on XRCC1 and XRCC3 polymorphisms and colorectal cancer risk / Z. Jiang [et al.] // Int J Colorectal Dis. ‒ 2010. – Vol. 25, № 2. – P. 169-180.
14. Wang M. XPD polymorphisms, cigarette smoking, and bladder cancer risk: a meta-analysis / M.Wang [et al.] // J Toxicol Environ Health. ‒ 2009. – Vol. 72, № 11-12. ‒ P. 698-705
15. Wang Q. Genetic polymorphisms of DNA repair genes and chromosomal damage in workers exposed to 1,3-butadiene / Q.Wang [et al.] // Carcinogenesis. ‒ 2010. ‒ Vol. 31, № 5. – P. 858-863.
16. Wu HC DNA double-strand break repair genotype and phenotype and breast cancer risk within sisters from the New York site of the Breast Cancer Family Registry (BCFR). /HC Wu, L Delgado-Cruzata, N Machella, Q Wang, RM Santella, MB Terry. //Cancer Causes Control., 2013. - №24 (12). – Р.2157-68