РОЛЬ ГЕНОВ-СУПРЕССОРОВ ОПУХОЛЕЙ P53 И CHEK2 В РАЗВИТИИ ОПУХОЛИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

С развитием молекулярной генетики изучение генетических детерминант нарушения процессов жизнедеятельности человека приобрели первостепенное значение. За последние годы, несомненно, одними из самых изучаемых генов являются гены-супрессоры опухолевого роста: BRCA1, BRCA2, р53, PTEN, CHEK2 и ряд других, играющих ключевую роль в поддержании здоровья нашего организма. Столь пристальное внимание к генам-супрессорам определяется, главным образом, значимостью продуктов, кодируемых данными генами, в защите от злокачественных новообразований, частота которых растет с каждым годом. По данным ВОЗ ожидается, что в ближайшие 20 лет число новых заболевших раком возрастет примерно на 70 % [18].

Биологическая роль опухолевых супрессоров заключается в обеспечении стабильности генома. Утрата функций супрессорных белков отмечается практически в каждом случае злокачественных заболеваний, а его недостаточность неминуемо приводит к развитию опухолей. Изучение роли антионкогенов позволяет разрабатывать не только новые подходы к лечению онкологических заболеваний, но и определять стратегию профилактики множества болезней. Однако, как показывают, популяционные исследования, маркерные локусы в одних и тех же генах могут сильно варьировать в зависимости от этногеографических особенностей индивидов [2, 9] Таким образом, изучение полиморфизмов генов с учетом популяционных различий является актуальным направлением генетико-эпидемиологических исследований.

В настоящей работе была изучена распространенность полиморфных вариантов генов-супрессоров опухолевого роста: CHEK2 и p53 среди жительниц Чеченской республики и их патогенетическая значимость в генезе злокачественных новообразований груди.

Материал и методы исследования.

Для молекулярно-генетического исследования использовали цельную периферическую кровь пациентов с клинически установленным диагнозом РМЖ (n=106). Материал набран с добровольного согласия пациентов, взятых на учет по месту проживания после установления диагноза и прохождения процедур химиотерапии (в 89 % случаев после резекции молочных желез) и пациентов, находящихся на стационарном лечении в Республиканском Онкологическом диспансере г. Грозный. Для выделения ДНК использовали наборы реагентов Diatom^TM DNA Prep200 (пр-во ООО «Изоген», Москва). Для определения мутантных вариантов гена CHEK2 использовали наборы реагентов «ОнкоГенетика CHEK2» компании «ДНК-технология», основанные на применении метода полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени и метод анализа кривых плавления. Для определения однонуклеотидного полиморфизма (SNP) rs17884159 гена p53 применяли метод ПЦР в режиме реального времени с оценкой результатов методом аллельной дискриминации, когда различия между гетерозиготами, гомозиготами дикого и минорного вариантов устанавливали по различиям в протекании реакций амплификации соответствующих праймеров.

Ген CHEK2 кодирует одноименный фермент CHEK2, который известен также как "CHK2" (MM 604373) представляющий собой киназу контрольной точки клеточного цикла, активация которого происходит в ответ на повреждение ДНК. В результате активации CHEK2 фосфорилирует белки BRCA1 и ТР53, управляя функцией опухолевой супрессии данных белков, и, тем самым предотвращает размножение клетки с повреждениями [4, 5, 10, 11, 12, 14, 15]

В гене CHEK2 обнаружено несколько функциональных полиморфизмов и мутаций, снижающих функциональную активность белка, частота которых варьирует в различных популяциях. Для женщин российской популяции со злокачественными новообразованиями молочной железы также характерна высокая частота мутаций в гене CHEK2. В российских популяциях мутации CHEK2 выявляются не менее чем у 2% больных со спорадической формой РМЖ, а при наследственных формах данный показатель возрастает как минимум до 5 % [7].

В настоящей работе изучены три наиболее распространенных в российской популяции полиморфизма гена CHEK2, носительство которых сопряжено с риском развития онкозаболеваний: 1100delC/IVS2+1G> A/470T>C.

Результаты генотипирования представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Частота мутаций в гене CHEK2 в группе пациентов с РМЖ и группе здоровых женщин

Полиморфные варианты в гене CHEK2 нами были обнаружены в двух случаях из 106 образцов ДНК, выделенных из крови женщин с опухолями молочной железы. В контрольной группе (n=100) изучаемые полиморфизмы не выявились.

Анализ частоты отдельно по каждому варианту полиморфизма дал следующие результаты.

Однонуклеотидный полиморфизм 1100delC, обусловленный делецией цитозина в 1100 положении является довольно частым вариантом для многих европейских популяций [6]. В значительной доле случаев аллель CHEK2 1100delC увеличивает риск к развития РМЖ в России [8]. Однако в настоящем исследовании не был обнаружен ни в группе пациентов, ни в группе здоровых женщин.

Другой изученный в настоящем исследовании полиморфный вариант гена CHEK2 IVS2+1G>A: ( IVS, от англ. intervening sequence) обусловлен заменой гуанина на аденин в донорском GT сайте сплайсинга второго интрона гена. Для минорного аллеля данного полиморфизма IVS2+1G>A гена CHEK2 характерна низкая встречаемость и неполная пенетрантность в отношении развития РМЖ [3]. Тем не менее, Батенева и ее коллеги отметили довольно высокие риски для мутации IVS2+1G>A в гене CHEK2 в отношении рака яичника в российской популяции [1].

По результатам настоящего исследования все респонденты оказались гомозиготными по мажорному аллею, минорный аллель в данной выборке не был зарегистрирован.

Из всех мутаций гена CHEK2 мутация 470T>C определяющая замену изолейцина на тирозин (Ile157Thr ) является самой распространенной. При этом исследователи отмечают, что частота ее встречаемости выше у здоровых лиц, по сравнению с пациентами. В настоящем исследовании полиморфный вариант 470C (Ile157Thr) был обнаружен у двоих пациентов, болеющих раком молочной железы. В процентном отношении это составило 2,02% (табл. 2).

Таблица 2

Распределение генотипов по полиморфному варианту IVS2+1G>A гена CHEK2

Анализ сопряженности обнаруженной мутации показал очень высокий риск заболевания раком молочной железы, отношение шансов (OR) составило 5,15 при 95 % доверительном интервале от 0,25 до 107,09. Однако результаты не достигали статистической значимости (P = 0,246)

Ассоциации всех мутаций, включенных в нашу диагностическую панель, с развитием РМЖ были подтверждены в исследованиях, проведенных в российской и этнически близких к ней популяциях % OR 1,4–4,0 [9, 13, 16, 17].

Однако, несмотря на достаточно распространенный характер встречаемости полиморфизмов в российской популяции в настоящей работе они не были отмечены. Вероятно, здесь имеет значение величина выборки. Однако многие исследователи указывают на славянский характер происхождения мутаций, чем можно также объяснять отсутствие их в изученной выборке. Таким образом, данные настоящего исследования показывают, что мутации 1100delC и IVS2+1G>A. в гене CHEK2 не участвуют в патогенезе рака молочной железы у жительниц Чеченской республики, тогда как замена 470T>C обнаруживает связь с риском развития рака молочной железы.

Таким образом, результаты работы показывают, что характер распределения полиморфных вариантов гена CHEK2 в популяции Чеченской республики отличается от других популяций России и необходимы дальнейшие масштабные исследования для поиска специфических маркерных локусов для рака молочной железы.

Ген p53 является ключевым геном, обеспечивающим стабильность генома и нарушения его структуры, очевидно, будет сказываться на экспрессии и функционировании клеток. Ген локализуется на 17 хромосоме (17p13.1). Для гена р53 установлено 19 полиморфизмов, из которых три считаются вовлеченными в канцерогенез: в 3 интроне, 4 экзоне, 6 интроне. Полиморфный вариант rs17884159 локализуется в области интрона NM_001126112.2:c.-26+4486C>T Частота полиморфного варианта достигает по данным базы NCBI [19] от 0 до 0, 02.

В настоящей работе проведен анализ однонуклеотидного полиморфизма (SNP) rs17884159 гена p53 с использованием ПЦР в режиме реального времени с оценкой результатов методом аллельной дискриминации, когда различия между гетерозиготами, гомозиготами дикого и минорного вариантов устанавливали по различиям в протекании реакций амплификации соответствующих праймеров. Результаты анализа установили SNP-изменения по критерию частоты полиморфного аллеля гена (табл. 3)

Таблица 3

Частота распределения генотипов и аллелей полиморфного варианта гена p53 26+4486C>T

Из данных приведенных в таблице видно, что частота минорного аллеля в исследованной выборке индивидов с раком молочной железы достигает 33,33 %, соответственно, частота мажорного аллеля составляет 66,67 %.

В контрольной выборке женщин, у которых на момент забора крови не было установлено патологий молочных желез и без случаев семейного рака в анамнезе частота искомого аллеля составила 20,0 %, частота аллеля дикого типа C, соответственно, 80,00 %.

Результаты генотипирования в группе здоровых женщин показали, что частота гомозиготного по мажорному аллелю составляет 56,94 %, тогда как гомозиготы по минорному аллелю отмечались только в двух случаях (2,7 %). Соответственно, частота гетерозиготного генотипа составила в контроле 40,27 % (табл. 4).

В группе женщин со злокачественными патологиями молочной железы генотипы распределись по данным дискриминации аллелей следующим образом: частота гомозигот по полиморфному варианту C и гетерозиготные носители минорного аллеля распределились в данной группе с одинаковой частотой 47,05 %, в то время как частота гомозиготного генотипа по аллелю T составила 5,8 %.

Таблица 4

Результаты ассоциативного анализа между полиморфным вариантом гена p53 и РМЖ

Сравнительный анализ частоты генотипов установил негативные ассоциации полиморфизма гена p53 rs17884159 проявляющиеся в повышенной по сравнению с группой контроля частоте гетерозиготного варианта гена в 1,2 раза и гомозиготного генотипа по минорному аллелю в 2,15 раза. (табл. 3). Статистический анализ различий в частоте полиморфных вариантов гена ТР53 rs17884159 между группами женщин с РМЖ и контроля показал, что обе группы находятся в равновесии Харди–Вайнберга.

Анализ сопряженности полиморфного варианта гена p53 rs17884159 со злокачественной трансформацией клеток молочной железы показал значимость минорного аллеля T в развитии рака. Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя отношения шансов (OШ) Однако различия не достигали статистической значимости. (табл. 4)

Таким образом, изучение роли полиморфных вариантов генов-супрессоров опухолей: ген p53 и ген CHEk K2 в патогенезе рака молочной железы у женщин выявил неоднозначный характер влияния изученных полиморфизмов на риск развития злокачественных новообразований груди и продемонстрировал необходимость проведения более масштабных исследований.

Список литературы:

1. Батенева Е.И.  Высокая частота мутаций в генах BRCA1, BRCA2, CHEK2, NBN, BLM у больных раком яичников в российской популяции /Е.И. Батенева //Гинекология, 2014. - № 4. - С.51-56
2. Батенева Е.И. Результаты генетического скрининга герминальных мутаций в генах BRCA1 И BRCA2 у больных раком молочной железы и больных раком яичников в российской популяции /Е.И. Батенева, М.Г. Филиппова, А.С. Тюляндина, О.В. Крохина, А.В. и др. //Онкогинекология, 2015. - № 3. - С.34-39
3. Соколенко А.П. Наследственные мутации при ранних, семейных и билатеральных формах рака молочной железы у пациенток из России /А.П.Соколенко //Сибирский онкологический журнал, 2008. - №3 (27). - С.43-49
4. Chaturvedi P. Мammalian Chk2 is a downstream effector of the ATM-dependent DNA damage checkpoint pathway. Chaturvedi P, WK Eng, Y Zhu, MR Mattern, R Mishra et al., //Oncogene.1999. -№18. – Р.4047-54
5. Chehab N.H. Chk2/hCdsI functions as a DNA damage checkpoint in G by stabilizing p53. / NH Chehab, A Malikzay, M Appel, TD. Halazonetis. //Genes Dev., 2000. - №14 (3). – Р.278-28.
6. CHEK2 Breast Cancer Case-Control Consortium: CHEK2*1100delC and susceptibility to breast cancer: a collaborative analysis involving 10,860 breast cancer cases and 9,065 controls from 10 studies //Am. J. Hum. Genet. 2004. - Vol. 74. - P. 1175–1182
7. Chekmariova E.V. CHEK2 1100delC mutation is frequent among Russian breast cancer patients. /E.V.Chekmariova, A.P.Sokolenko, K.G. Buslov et al.  // Breast Cancer Res. Treatm. 2006. -  Vol.100. -  P. 99–102
8. Chekmariova E.V. CHEK2 1100delC mutation is frequent among Russian breast cancer patients. /E.V.Chekmariova, A.P.Sokolenko, K.G. Buslov, A.G.Iyevleva, Y.M. Ulibina, M.E.Rozanov, N.V.Mitiushkina, A.V Togo., D.E.Matsko et al., // Breast Cancer Res Treat, 2006. - № 100. – Р. 99-102
9. Cybulski C. Selected aspects of inherited susceptibility to prostate cancer and tumours of different site of origin. / C.Cybulski //Hered Cancer Clin Pract 2007. – №5 (3). – С.164–179
10. Falck J. The ATM-Chlc2-cdc25A checkpoint pathway guards against radioresistant DNA synthesis. /Falck J, Mailand N, Syljuasen RG Bartek J, Lukas J. //Nature, 2001. - № 410(6830). - Р. 842-847
11. Lee JS, hCdsI-mediated phosphorylation of BRSA1 regulates the DNA damage response.  / JS Lee, KM Collins, AL Brown, CH Lee, JH Chung, //Nature, 2000 - №404(6774). - P.201-4
12. Matsuoka S. Ataxia telangiectasia-mutated phosphorylates Chk2 in vivo и in vitro. /S Matsuoka, G Rotman, A Ogama, Y Shiloh, K Tamai, S Eledge //J.Proc Natl Acad Sci USA, 2000. - №97 (19). – Р.10389-94
13. Prokofyeva D. et al. Nonsense mutation p.Q548X in BLM, the gene mutated in Bloom's syndrome, is associated with breast cancer in Slavic populations. / D.Prokofyeva et al.  //Breast Cancer Res Treat 2013. - №137 (2). – С.533–539.
14. Shieh SY The human homologs of checkpoint kinases ChkI и CdsI (Chk2) phosphorylate p53 at multiple DNA damage-inducible sites. /SY Shieh, J Ahn, K Tamai, Y Taya, C. Prives // Genes Dev., 2000. - №14. – Р.289-300
15. Shieh SY. The human homologs of checkpoint kinases ChkI и CdsI (Chk2) phosphorylate p53 at multiple DNA damage-inducible sites. /SY Shieh, J Ahn, K Tamai, Y Taya, C. Prives // Cancer Res., 2000. -  №60. Р.5934-6
16. Sokolenko A.P. et al. High prevalence and breast cancer predisposing role of the BLM c.1642 C > T (Q548X) mutation in Russia. /А.Р.Sokolenko et al.//Int J Cancer 2012. - №130 (12). – С.2867–2873.
17. Steffen J. et al. Germline mutations 657del5 of the NBS1 gene contribute significantly to the incidence of breast cancer in Central Poland. //Int J Cancer, 2006. - №15 (2). – С.472–475
18. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/ru/
19. https://www.ncbi.nlm.nih.gov