ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ (PCR REAL-TIME) С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРОЧИПОВОГО АМПЛИФИКАТОРА

На сегодняшний день ПЦР успешно применяют для диагностики наследственных, инфекционных заболеваний, в том числе для выявления возбудителей, трудно и длительно культивируемых на питательных средах. Полимеразная цепная реакция позволяет исследовать генотип микроорганизмов, оценивать их вирулентность, определять их устойчивость к антибиотикам, обнаруживать генно-модифицированные объекты в пищевых продуктах и др. [4]

Метод ПЦР, открытый в 1983 году Кэрри Мюллисом, до сих пор считается ведущим в научных исследованиях и диагностике в практической ветеринарии. Полимеразная цепная реакция является высокочувствительной и высокоспецифической реакцией, способной обнаружить инфекционный агент в концентрации, которую невозможно обнаружить другими традиционными методами [2].

Ежегодно на рынке появляются десятки новых тест-систем для ПЦР-анализа, себестоимость которого неуклонно снижается, что способствует все более широкому использованию метода в лечебных и диагностиче­ских учреждениях. Среди большого многообразия гибридизационных методов анализа ДНК, метод ПЦР наиболее широко используется в клинической лабораторной диагностике [3].

Проведение анализа с использованием метода ПЦР включает несколько этапов:

1.Выделение ДНК (РНК) из клинического образца.

2.Амплификация специфических фрагментов ДНК

3.Детекция продуктов амплификации. [1].

Целью настоящей работы является изучить этапы проведения метода ПЦР в режиме реального времени (PCR real-time) на микрочипах с лиофилизированными тест-системами, а также анализ достоинств и недостатков молекулярно-генетического метода диагностики.

Процедура подготовки образца состоит из обязательной очистки от посторонних примесей – ингибиторов амплификации, лизиса микроорганизмов и экстракции ДНК. Выделение ДНК проводили с использованием оптимизированных коммерческих наборов: «ДНК–Сорб-АМ» и «АмплиПрайм Сорб-В» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва).

Для проведения амплификации применяли микрочиповый ПЦР–РВ амплификатор «АриаДНА», разработанный ООО «Люмекс-маркетинг» (рис 1).

Рисунок 1. Микрочиповый ПЦР–РВ амплификатор «АриаДНА»

Микрочипы с лиофилизированными тест–системами позволилили осуществить комплексный анализ возбудителей (рис.2).

Рисунок 2. Микрочип в картридже прибора, заполненный герметизирующей жидкостью для предотвращения испарения проб

Гибкая система производства обеспечивает возможность создания чипов под заказ пользователя.

По окончании ПЦР-анализа происходит автоматическая генерация отчетов с информацией о наличии или отсутствии искомых возбудителей (наличии или отсутствие свечения) посредством построения графика анализа результатов амплификации специфических участков ДНК.

Амплификатор «АриаДНА» осуществляет ПЦР-РВ анализ с использованием двухканального флуоресцентного детектора. Чип с иммобилизованными в микрореакторах компонентами ПЦР-смеси позволяет сократить время подготовки к проведению эксперимента, упростить и ускорить процедуру анализа, а также делает возможным скрининг большого числа проб за короткое время.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Результаты были интерпретированы в зависимости от наличия (или отсутствия) пересечения на графике кривой свечения пороговой линии. Результат считали достоверным только в случае прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации (рис.3).

Рисунок 3. График регистрации результатов ПЦР в режиме реального времени на микрочипе, содержащем лиофилизированные тест-системы

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Использование ПЦР в микрочиповом формате позволяет уменьшить количество манипуляций при постановке реакции, за счет чего снижается вероятность ошибок. Кроме того, использование ПЦР на микрочипах с лиофилизированными тест-системами позволяет выявлять несколько патогенов, или для выявления одного, но у большой группы исследуемых животных одновременно.

Список литературы:

1. Бикбулатова С. М., Чемерис Д. А., Никоноров Ю. М. и др. Способы детекции результатов полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Вестник Башкирского университета № 1, том 17, 2012.
2. Скворцова Н.Н. Основы генетической инженерии. Учеб.-метод. пособие. – СПб.: Университет ИТМО; ИХиБТ, 2015. – 58 с.
3. Сухинин А.А. Бактериологический и молекулярно-генетический метод для выделения и идентификации Mycoplasma bovis у крупного рогатого скота/ Сухинин А.А., Смирнова Л.И., Макавчик С.А. //Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии -№ 4-СПб-2016-C. 80-84.
4. Шнайдер, Н. А., Бутьянов, Р. А. Основные принципы метода полимеразной цепной реакции. Методическое пособие для внеаудиторной работы студентов 3-4 курсов по специальностям лечебное дело (060101) и педиатрия (060103). – Красноярск: Изд-во ГОУ ВПО КрасГМА, 2007. – 42 с.