РАЗРАБОТКА РЕАКЦИИ МИКРОНЕЙТРАЛИЗАЦИИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ НОДУЛЯРНОГО ДЕРМАТИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Актуальность темы. Нодулярный дерматит крупного рогатого скота (кожная бугорчатка, кожно-узелковая сыпь, узелковая экзантема) - это трансграничная вирусная болезнь крупного рогатого скота (КРС), проявляющаяся персистентной лихорадкой, потерей живой массы, поражением лимфатической системы, отеком внутренних органов и подкожной клетчатки, с образованием бугорков и их некрозом.

Болезнь наносит значительный экономический ущерб в скотоводстве, так как вызывает существенное снижение удоя молока, потерю живой массы тела. У стельных животных отмечают аборты, быки могут стать временно или постоянно бесплодными [1, 6, 7]. В 2015 г. первые случаи НД КРС в России были зарегистрированы на территории Республики Дагестан и Чеченской Республики.

25 мая 2016 года НД КРС вновь зарегистрирован в России, на территории Краснодарского края. С 29 мая по 12 июня на территории Республики Дагестан выявлено 15 очагов данного заболевания, очаги выявлены на фермах, где содержалось в общей сложности 36645 животных.

Приведенные данные указывают, что угроза появления НД КРС в других регионах РФ и его дальнейшее распространение крайне велики, что может вызвать серьезные социально-экономические последствия для отечественного животноводства.

В связи с этим необходимо иметь высокоэффективные диагностические препараты и средства специфической профилактики, которые в короткие сроки позволили бы идентифицировать  возбудитель НД КРС  и быстро купировать распространение инфекции. Это обстоятельство требует постоянных поисков новых штаммов, пригодных для изготовления средств диагностики и специфической профилактики НД КРС.

Для выявления вируснейтрализующих антител к вирусу НД рекомендуемым методом является реакция нейтрализации. Антитела к вирусу можно обнаружить, начиная со 2 дня после начала клинических признаков и до 7 месяцев, но значительный рост титров происходит обычно между 21 и 42 днем после инфицирования [3].

Целью данной работы была разработка и оптимизация реакции микронейтрализации (РМН) для обнаружения антител к вирусу НД в сыворотках крови животных.

Материалы и методы

Вирус: В работе использовали штамм ВНД КРС/Дагестан/2015, полученный путем последовательных пассажей полевого изолята в культуре клеток тестикул ягненка (ТЯ) в референтной лаборатории болезней крупного рогатого скота ФГБУ «ВНИИЗЖ» [4]. Вирус НД КРС титровали микрометодом в стерильных 96-луночных плоскодонных культуральных планшетах общепринятым методом [2]. Титр вируса рассчитывали по  методу Рида и Менча и выражали в lg ТЦД₅₀/см³ [5].

На основании результатов предварительного титрования готовили рабочие разведение вируса НД КРС в пределах 100 ТЦД₅₀/0,05 см³.

Сыворотки: При разработке РМН использовали образцы сывороток крови, отобранные как от экспериментально зараженных, так и от больных животных. В качестве положительного и отрицательного контроля использовали сыворотки крови КРС с заведомо известным статусом. Контрольные и исследуемые сыворотки инактивировали 30 мин на водяной бане при 56ºС и в необходимом объеме использовали для постановки РМН.

Постановка основного опыта РМН с использованием культуры клеток включает два этапа: постановка контролей (контроль рабочей дозы вируса, контроль культуры клеток, контроль среды, контроль специфических сывороток) и тестирование образцов сывороток на наличие антител. Оба этапа основного опыта ставили одновременно с использованием стандартных реагентов  и материалов одной серии.

Для этого готовили двукратные разведения исследуемых сывороток в объеме 0,05 см³ на питательной среде ПСП. Далее во все лунки планшета вносили по 0,05 см³ рабочего разведения вируса (100 ТЦД₅₀/0,05 см³). Планшеты инкубировали в СО2 - инкубаторе при температуре 37°С в течение одного часа. После часового контакта во все лунки планшета вносили суспензию культуры клеток ЯДК-04 с концентрацией клеток 0,4-0,5х10⁶ кл/см³ и помещали в СО2 – инкубатор при температуре 37ºС на 96-120ч. Наблюдения проводили с использованием инвертируемого микроскопа, регистрируя лунки с выраженным ЦПД вируса и/или с цельным неповрежденным монослоем.

При исследовании сывороток крови КРС положительной считали пробы сывороток, нейтрализующие  100 ТЦД вируса в разведении 100 ТЦД₅₀/0,2 см³ в разведении 1:8.

Результаты

На первом этапе исследований определяли наиболее оптимальную посевную концентрацию клеток. Для этого в ряд лунок вносили различные концентрации клеточной суспензии и ежедневно вели наблюдение в течение 48 часов. В результате проведенных опытов установлено, что ровный монослой образовывался только через 48 часов в лунках, где концентрация клеток была 0,4-0,5х10⁶ кл/см³.

На следующем этапе была разработана методика титрования вируса НД КРС. Титрование вируса проводили микрометодом в стерильных 96-луночных плоскодонных культуральных планшетах в объеме 0,2 см³/лунку.

На основании результатов предварительного титрования готовили 3 рабочих разведения вируса. Титрование контрольных сывороток проводили с тремя дозами (100, 200, 300) вируса.  Наиболее оптимальной была выбрана рабочая доза вируса в пределах 100 единиц. Негативные сыворотки при рабочих дозах 100-300 давали одинаковые отрицательные результаты.

С помощью РМН было проведено исследование 188 проб сывороток крови животных, полученных из различных субъектов РФ (Республика Калмыкия, Республика Дагестан, Республика Чечня, Астраханская область, Краснодарский край), а также 250 проб сывороток крови от КРС, полученных в ходе проведения научно-исследовательской работы по изучению иммунобиологических свойств вируса НД КРС у естественно-восприимчивых животных. Результаты исследований частично представлены в табл. 1.

Таблица 1

Результаты исследований сывороток крови КРС на наличие антител к вирусу нодулярного дерматита с использованием РМН

*-титр в РМН ≥8 – положительный результат

Из табл. 1 видно, что разработанный способ постановки РМН позволяет выявлять антитела к вирусу НД КРС в сыворотках крови КРС.

Для подтверждения специфичности разработанной реакции были использованы гетерологичные сыворотки крови КРС, имеющие антитела к вирусам инфекционного ринотрахеита (ИРТ) КРС, вирусной диареи (ВД) КРС, парагриппа-3 (ПГ-3) КРС, полученные после иммунизации животных вакцинами эмульсионными инактивированными производства ФГБУ «ВНИИЗЖ» (табл.1).

В пробах сывороток крови животных (специфических к вирусам ПГ-3, ИРТ и ВД), антитела к вирусу НД КРС в РМН не выявляли.

Выводы

В результате проведенных исследований были разработаны и оптимизированы условия постановки РМН для выявления антител к вирусу НД КРС. Была показана специфичность и чувствительность данного метода.

Указанная реакция может быть использована для обнаружения и определения поствакцинальных и постинфекционных  антител в сыворотке крови животных.

Список литературы:

1. Кодекс здоровья наземных животных МЭБ / Т.1. – 23 изд. – Paris, 2014. – Гл. 1.2. Критерии включения болезней, инфекций и инфестаций в список МЭБ. – С. 5.
2. Методические рекомендации по выявлению антител к вирусу нодулярного дерматита крупного рогатого скота в реакции нейтрализации микрометодом / И.Н. Шумилова, С.В. Кононова, О.П. Бьядовская, А.В. Кононов [и др.]. – Владимир, ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2016. – 19 с. 1. Инфекционная патология животных / под ред. А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьёва, Е.А. Непоклонов, Е.С. Воронина // М.: Академкнига, 2006. – Т. 1. – С. 782-786.
3. Официальный сайт Международного эпизоотического бюро (МЭБ) – URL: http://www.oie.int/eng/info/.
4. Пат. 2606254 Российская Федерация, МПК6 C12N 7/00 Штамм вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота Dermatitis nodularis bovum, рода Capripoxvirus для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики нодулярного дерматита крупного рогатого скота / Кононова С.В., Кононов А.В., Шумилова И.Н., Бьядовская О.П., Бабин Ю.Ю., Шишков А.В., Мищенко В.А., Диев В.И., Камалов И.Г., Константинов А.В. - № 2016118457; заявл. 11.05.16.; опубл. 10.01.17.
5. Практикум по ветеринарной вирусологии / Троценко Н.И. Троценко, Р.В. Белоусова, Э.А. Преображенская. – М.: Колос, 2000. – 272 с.
6. Evaluation of different diagnostic methods for diagnosis of lumpy skin diseases in cows / W.S. Awad, A.K. Ibrahim, K. Mahran [et al.] // Trop. Anim. Health. Prod. – 2010. – Vol. 42. – P. 777-783.
7. Weiss K.E. Lumpy skin disease // Virol. Monogr. – Vienna, New York, 1968. – Vol. 3.- P. 111-131.