ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПРЕДИКТЫ РАКА: РОЛЬ АЛЛЕЛЯ CYP2D6*4 В ЭТИОЛОГИИ РМЖ

GENETIC PREDICTS OF CANCER: THE ROLE OF THE CYP2D6 * 4 ALLEL IN THE ETIOLOGY OF BC

Aina Dutaeva

Master's student, Department of Cell Biology, Morphology and Microbiology, Chechen State University,

Russia, Grozny

Iman Israilova

Master's student, Department of Cell Biology, Morphology and Microbiology, Chechen State University,

Russia, Grozny

Khava Sakhabova

Master's student, Department of Cell Biology, Morphology and Microbiology, Chechen State University,

Russia, Grozny

Amina Magomadova

Master's student, Department of Cell Biology, Morphology and Microbiology, Chechen State University,

Russia, Grozny

АННОТАЦИЯ

Исследование полиморфного варианта гена CYP2D6 *4 в группе здоровых женщин и 80 пациенток с диагнозом РМЖ показало, что нефункциональный аллель CYP2D6*4, наиболее широко распространенный в чеченской популяции, может оказывать влияние на развитие опухоли груди. Результаты могут могут быть учтены при оптимальной гормональной терапии, поскольку пациенты с низкой активностью CYP2D6 могут недостаточно преобразовывать тамоксифен в его активный метаболит эндоксифен.

ABSTRACT

The study of the polymorphic variant of the CYP2D6 * 4 gene in a group of healthy women and 80 patients with breast cancer showed that the non-functional allele CYP2D6 * 4, which is the most widespread in the Chechen population, can influence the development of breast tumors. The results can be considered with optimal hormone therapy, as patients with low CYP2D6 activity may not sufficiently convert tamoxifen to its active metabolite endoxifen.

Ключевые слова. РМЖ, полиморфизм, CYP2D6*4, тамоксифен.

Keywords. BC, polymorphism, CYP2D6 * 4, tamoxifen.

Среди множества биологических маркеров в последнее время на первый план в диагностике заболеваний, благодаря развитию технологий секвенирования выходят генетические маркеры. Секвенирование генома сделало возможным обнаружение практически любой мутации. Таким образом, вопрос использования ДНК-маркеров в качестве предиктов развития мультифакториальных заболеваний (МФЗ), таких как сердечно-сосудистые, онкологические, нейродегенеративные, аутоиммунные и т.д. и определения фармакогенетических аспектов их терапии приобретает все большую актуальность [1]. 

Нарушение процессов детоксикации, опосредованные нефункциональными вариантами генов детоксикации ксенобиотиков, играет важную роль в развитии предрасположенности к различным типам опухолей, сниженной эффективности некоторых лекарственных средств. Цитохром P450 2D6 (CYP2D6) представляет собой фермент семейства цитохромов P450, участвующий в окислительной биотрансформации ксенобиотиков, канцерогенов и различных клинически важных лекарств [10]. Ген, кодирующий цитохром P450 2D6 является одним из самых «полиморфных» генов. Многие из аллельных вариантов частично или полностью способствуют изменению скорости метаболизма лекарств, ассоциированного с CYP2D6. Изучение полиморфизма гена CYP2D6 для каждого пациента с целью выявления тех, которые находятся в группе риска, имеет большое значение для предиктивной и персонифицированной медицины.

Цель настоящей работы исследовать полиморфный вариант гена CYP2D6 *4 в когорте здоровых лиц и онкопациентов.

Объекты исследования. В настоящее исследование включены 80 пациенток с диагнозом рак молочной железы, проходивших лечение в онкодиспансере ГБУ "Республиканский Онкологический Диспансер" г. Грозный, а также здоровые женщины, у которых на момент исследования не было обнаружено опухолей (n=120). От каждого участника было получено информированное согласие. Средний возраст женщин, вошедших в исследование, составил 44 ± 6,12. Возрастной диапазон женщин с диагнозом РМЖ варьировал от 18 до 72 лет. Часть пациентов имела семейный анамнез заболевания раком, из которых рак груди составил 4,7%. Большинство пациенток находились в пременопаузе. (89,3%). 93,5 % пациенток были гормонально-положительными. У 51,4% раковая опухоль находилась на 2-й стадии. У большинства пациентов (79,6%) не наблюдалось признаков метастазирования.

Экстракция ДНК. У каждого респондента отобрали по 2-5 мл венозной крови в вакуумную пробирку с антикоагулянтом ЭДТА. Образцы до этапа выделения хранили в морозильной камере при - 40°C - 20°C. Геномную ДНК экстрагировали из 200 мкл периферической крови с использованием набора для выделения ДНК на основе гуанидин тиосульфата в соответствии с протоколом производителя (ООО "Галарт-Диагностикум", г. Москва).

Полимеразно-цепная реакция (ПЦР). Для определения полиморфизма гена CYP2D6 (CYP2D6*4) использовали метод тетрапраймерной полимеразно-цепной реакции. Образовавшиеся фрагменты (амплифакты) исследовали путём горизонтального гель-электрофореза.

ПЦР проводили в амплификаторе Applied Biosystems (США) в соответствии с отработанной ранее программой.

Статистический анализ. В исследовании использовалась параметры описательной статистики, такие как, среднее значение, стандартное отклонение, частота и процент, которые рассчитывались с использованием программы Statistica 6.0, адаптированную в Excel. При определении прогностического характера полиморфизма рассчитывали значение OR (отношение шансов) с помощью программы WinPepi. Порог достоверности принимали за ≤ 0,05.

Результаты и обсуждение. Наибольшую клиническую значимость из описанных полиморфизмов гена CYP2D6 имеют полиморфные варианты CYP2D6*3 и CYP2D6*4. поскольку, не имея ферментативной активности, они ответственны за формирование у человека фенотипа «слабый» («медленный») метаболизатор. Полиморфизм CYP2D6*4 является самым распространённым вариантом гена, частота встречаемости в европейских популяциях составляет 20-25%. Для анализа частоты аллеля CYP2D6*4 и соответствующих ему генотипов в популяционной выборке здоровых женщин (n=120) нами было проведено генотипирование методом ПЦР с последующей визуализацией продуктов амплификации с помощью горизонтального электрофореза.

Результаты генотипирования приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Частота генотипов полиморфного варианта гена CYP2D6 (G1846A (*4), rs3892097)

*если значение P <0,05 - , то равновесие не соответствует HWE

Частота аллеля *4 гена CYP2D6 составила 13,3%. В популяционной выборке не были обнаружены гомозиготы по аллелю *4. Частота гетерозигот составила 26,7%.

Для оценки влияния полиморфизма на образование злокачественных опухолей молочной железы нами был проведен анализ встречаемости аллеля CYP2D6*4 в выборке пациентов с диагнозом - рак молочной железы. Результаты представлены в таблице 1. Частота гетерозиготных носителей нефункционального аллеля составила 37,97 %, а частота непосредственно аллеля у пациентов с РМЖ – 18,75%.

Сравнительный анализ частоты гетерозигот в двух выборках (рис.1) показывает, что среди онкопациентов частота носителей аллеля выше, по сравнению со здоровой группой. 37,5% против 26,7%. Частота минорного аллеля также выше в группе пациентов. Измерение ОШ показывает, что наличие аллеля *4 может оказывать влияние на развитие рака груди (ОШ = 1,65 95% C.I. = 0,90-3,02). Однако, для достоверности исследование необходимо повторить в расширенной выборке.

Рисунок 1. Сравнительный анализ частоты генотипов полиморфного вариантов гена CYP2D6 в группе здоровых и больных РМЖ женщин

Обсуждение. На сегодняшний день крупномасштабные генетические скрининги выявили более сотни локусов, связанных с риском рака груди, указывающих на полигенный характер онкопатологии. Около 5–10% всех случаев РМЖ является результатом мутаций зародышевой линии в генах предрасположенности к РМЖ, до 30% из-за патогенных мутаций в генах- супрессорах опухолей BRCA1 и BRCA2 и в меньшей степени, из-за мутации в других генах [6]. Выявление большого количества генетических предиктов может служить дополнительным инструментом для персонализированного скрининга рака груди с учетом риска и впоследствии –фармакогеномики и генотерапии.

В последнее время интерес ученых привлек один из множества генов семейства цитохромов P450 ген CYP2D6. Особенностью этого гена является его полиморфность. На сегодняшний день обнаружено более 133 звездных (*) аллелей CYP2D6 среди мировых популяций разного происхождения [3, 4].

Среди них полнофункциональные аллели, аллели с пониженной функцией и нулевые (нефункциональные) аллели, которые передают широкий диапазон активности ферментов, от отсутствия активности до сверхбыстрого метаболизма субстратов. Исследования показывают, что CYP2D6 имеет значительное влияние на фармакокинетику примерно 50% препаратов, используемых в клинической практике, которые являются субстратами CYP2D6.

Лица, гомозиготные по двум нефункциональным аллелям, квалифицируют как медленные или слабые метаболизаторы» (poor metabolizers – PM); носители одного из функциональных аллелей – «промежуточные метаболизаторы» (intermediate metabolizers – IM); гомозиготы функционально активных копий гена CYP2D6 – «быстрые метаболизаторы» (extensive metabolizers – EM);  и тех, у кого множество копий (CNV) функциональных генов – «ультрабыстрыми метаболизаторами» (ultraextensive metabolizers – UM) [2]. Частота аллелей CYP2D6 значительно различается среди различных этнических групп. Аллель CYP2D6 *10 был описан как наиболее часто мутирующий ген в различных странах Азии, включая Китай, Японию и Корею; однако нефункциональный аллель CYP2D6 *4, как сообщается, является наиболее распространенным среди европейцев [7]. Согласно данным, полученным при изучении российской популяции, частота распространения CYP2D6*4 в гомо- и гетерозиготном состоянии сопоставима с таковой в европейской популяции и составляет 30 % [2].

Частота гетерозигот в популяционной выборке в настоящем исследовании близка к европейским показателям и составила 26,7%. В то же время гомозигот по аллею *4 обнаружено не было.

О влиянии вариантов гена CYP2D6 на риск развития рака молочной железы ранее сообщали несколько исследователей. В частности, результаты исследования индийских ученых показывают, что полиморфизм CYP2D6 * 4 играет важную роль в этиологии рака молочной железы, а также в определении гормональной терапии тамоксифена [9]. О риске развития наследственного РМЖ у украинских пациентов с генотипом *4*4 гена CYP 2D6 по сравнению с контрольной группой было сообщено украинскими исследователями в 2011 году. Ими было обнаружено, что частота гетрозиготного генотипа (IM) выше в группе женщин с семейным анамнезом рака груди (41,79%). Отмечена достоверная разница между частотой генотипов *1*1 (ЕМ) и *1*4 (ІМ) у женщин с PR-положительными и PR-отрицательными опухолями [5].  Результаты другого исследования также показали, что полиморфизм CYP2D6*4 играет важную роль в этиологии рака груди и может помочь в планировании гормональной терапии тамоксифена [9]. В тоже время превентивное исследование IBIS-I не подтвердили связи между фенотипом CYP2D6 и риском рака груди или развитием эндокринных симптомов у женщин, получавших тамоксифен [8].

Заключение. Настоящее исследование продемонстрировало, что аллель CYP2D6*4 может оказывать влияние на развитие раковой опухоли груди. Нефункциональный аллели CYP2D6*4, вероятно, наиболее распространенный аллель у пациентов с раком груди, проживающих в Чеченской Республике.  Полученные результаты могут повлиять на выбор оптимальной гормональной терапии, поскольку пациенты с низкой активностью CYP2D6 могут недостаточно преобразовывать тамоксифен в его активный метаболит эндоксифен. Однако основным ограничением настоящего исследования было относительно небольшая величина выборки. Поэтому для верификации полученных данных необходимо расширить выборку и увеличить число анализируемых вариантов гена CYP2D6.

Список литературы:

1. Белушкина Н.Н. Генетические исследования мультифакториальных заболеваний в концепции персонализированной медицины. / Белушкина Н.Н., Чемезов А.С., Пальцев М.А. //Профилактическая медицина. 2019. - №22(3). - Р.26-30. https://doi.org/10.17116/profmed20192203126
2. Любченко Л.Н. Фармакогенетическое тестирование аллельных вариантов гена cyp2d6 при гормоноположительном раке молочной железы. /Любченко Л.Н., Филиппова М.Г., Шендрикова Т.А., Жукова Л.Г., Мехтиева Н.И., Крохина О.В., Портной С.М. // Успехи молекулярной онкологии. 2017. - №4(3). - Р.57-66.
3. Darneya K. Environment International Human variability in polymorphic CYP2D6 metabolism: Implications for the risk assessment of chemicals in food and emerging designer drugs /K.Darneya, L.S.Lautza, C.Béchauxa, W.Wiecekb, E.Testaic, B.Amzald, J.L.C.M.Dornee //Environment International. 2021. - V.156. – Р. 1-17
4. https: //www.pharmvar. org /
5. Levkovich NN. Association of polymorphic G1934A variant (allele *4) of CYP2D6 gene with increased risk of breast cancer development in Ukrainian women. / Levkovich NN, Gorovenko NG, Myasoedov DV.  //Exp Oncol. 2011. - №33(3). - Р.136-139.
6. Mars N. The role of polygenic risk and susceptibility genes in breast cancer over the course of life. / Mars N., Widén E., Kerminen S. et al. //Nat Commun, 2020. - №11. -Р. 6383. https://doi.org/10.1038/s41467-020-19966-5.
7. Saghafi F. CYP2D6*3 (A2549del), *4 (G1846A), *10 (C100T) and *17 (C1023T) genetic polymorphisms in Iranian breast cancer patients treated with adjuvant tamoxifen. / Saghafi F, Salehifar E, Janbabai G, Zaboli E, Hedayatizadeh-Omran A, Amjadi O, Moradi S. //Biomed Rep., 2018. - №9(5). - Р.446-452. doi: 10.3892/br.2018.1145.
8. Sestak I. Relationships between CYP2D6 phenotype, breast cancer and hot flushes in women at high risk of breast cancer receiving prophylactic tamoxifen: results from the IBIS-I trial. / Sestak I., Kealy R., Nikoloff M. et al. //Br J Cancer, 2012. - №107. -Р. 230–233 (). https://doi.org/10.1038/bjc.2012.278.
9. Surekha D. CYP2D6*4 polymorphisms and breast cancer risk. / Surekha D, Sailaja K, Nageswararao D, Padma T, Raghunadharao D and Vishnupriya S. //Biology and Medicine, 2010. - №2 (4). -Р.49-55
10. Yalcıntepe S. The CYP4502D6 *4 and *6 alleles are the molecular genetic markers for drug response: implications in colchicine non-responder FMF patients. / Yalcıntepe S, Ozdemır O, Sılan C, Ozen F, Uludag A, Candan F, Sılan F. //Eur J Drug Metab Pharmacokinet. 2016. - №41(3). -Р.281-6. doi: 10.1007/s13318-015-0255-8.