ИНКАПСУЛИРОВАНИЕ КЛЕТОК В АЛЬГИНАТЕ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ЛЕЧЕНИИ ГЕМОФИЛИИ А

Гемофилия А представляет собой хроническое генетическое кровотечение, вызванное дефицитом гена фактора VIII (FVIII), расположенного на кончике длинного плеча Х-хромосомы [14, с. 12]. FVIII является критическим белком для свертывания крови, и в результате простое сокращение или падение могут вызвать гематомы, кровотечение в суставах или сильное кровотечение. Более 50% пациентов с гемофилией А в США страдают тяжелой формой гемофилии, при которой уровень FVIII составляет менее 1% от нормального уровня циркуляции, что приводит к спонтанному кровотечению в суставах и кровоизлияниям, что может иметь летальные последствия [1, с. 38].

Белок FVIII является одним из самых больших белков в организме человека, который состоит из 2332 аминокислот с молекулярной массой около 300 кДа [8, с. 103]. Он является частью внутреннего каскада свертывания крови, который непосредственно участвует в активации FX, приводящем к образованию фибринового сгустка. Печень является основным источником секреции FVIII. Помимо печени, ее мРНК была обнаружена в селезенке, почках, лимфатических узлах и легких [10, с. 3983]. С тех пор многие исследователи подтвердили, что основными производителями FVIII являются не гепатоциты, а эпителиальные клетки [2, с. 184].

В настоящее время гемофилия лечится заменой FVIII рекомбинантными FVIII (rFVIII) концентратами, очищенными in vitro от сконструированных клеток млекопитающих. Однако, основным ограничением заместительной терапии является развитие ингибиторов, т. е. антител, направленных против введенных концентратов после такой терапии.  Ингибитор представляет собой поликлональное высокоаффинное антитело IgG, которое специфически нейтрализует прокоагулянтную активность соответствующего фактора свертывания крови, что затрудняет остановку кровотечений [15, с. 201].

В настоящее время для искоренения ингибиторов разрабатываются новые продукты, которые препятствуют образованию антител против rFVIII. Новые продукты продлевают период полураспада или действуют разными путями, например, за счет увеличения выработки тромбина за счет снижения естественной антикоагулянтной активности, вместо замещения дефицитного белка, тем самым снижая частоту инъекций и потенциально снижая их иммуногенность [5, с. 2].  Индукция иммунной толерантности может быть использована для искоренения ингибиторов и включает частые инъекции концентратов в течение многих месяцев. Исследование Международной иммунной толерантности показало, что, хотя и высокая доза (200 МЕ / кг) в день, и низкая доза (50 МЕ / кг) через день одинаково эффективны при индуцировании толерантности, пациенты с низкой дозой лечения имели больше кровотечений в первые 5 месяцев терапии [12, с. 13].

В 2008 году De Groot и его коллеги определили путем компьютерного сканирования двух эпитопов (Трегитопы 289 и 167) в Fc-области человеческого IgG, которые потенциально могут связываться с индуцирующими толерантность и индуцировать регуляторные Т-клетки [6, с. 3306]. Они показали, что трегитопы способны индуцировать антигенспецифическую иммунную модуляцию и снижать B- и T-клетки-специфический иммунный ответ [3, с. 237]. Кроме того, антигенспецифическая модуляция иммунного ответа была показана после совместного введения трегитопов (289 или 167 в Fc) с антигенами типа 1 (T1D) -специфические антигены (PPI) и антигенами OVA [4, с. 440].

Новейшим методом лечения является генная терапия ex vivo, где Fc, производящие сконструированные клетки, имплантируются пациенту. Генная терапия ex-vivo позволяет избежать проблем безопасности, таких как риск мутагенеза и интеграции, но возникает проблема иммунного отторжения имплантированных клеток [9, с. 107]. Таким образом, обычно аутологичные клетки должны использоваться для метода ex vivo.

Инкапсулирование включает в себя закрытие клеток в полупроницаемой альгинатной полимерной мембране, которая позволяет диффузию питательных веществ и Fc, но не иммунных клеток, защищая заключенные клетки от иммунитета хозяина. Доставка Fc инкапсулированными клетками помогла бы избежать повторных инъекций Fc, используемых в текущей терапии, а также обходить проблемы безопасности и иммунного отторжения, связанные с доставкой вируса в потенциальный подход генной терапии.

Инкапсулирование клеток в альгинате было впервые описано Lim и коллегами, где они инкапсулировали панкреатические островки в альгинатном геле, имплантировали капсулы у крыс и смогли продемонстрировать долгосрочную жизнеспособность и терапевтический эффект in vivo в закрытых островках до 3 недель [11, с. 908]. Инкапсуляция островков поджелудочной железы остается наиболее популярным применением клеточной инкапсуляции, и она даже позволяет имплантацию ксенотрансплантатов [13, с. 687]. Инкапсулирование и дальнейшая трансплантация жизнеспособных клеток в клинических целях дает ряд преимуществ перед трансплантацией клеток, создавая систему для преодоления иммунного ответа хозяина и поддержания долговременной функциональности вложенных клеток, обеспечивая тем самым постоянную доставку секретируемого терапевтического продукта [7, с. 5603].

Генная терапия разрабатывается как новое средство лечения многих генетических болезней. Таким образом, в этом исследовании мы попытались разработать инкапсулированные клетки с плазмидой мышиной Fc для доставки Fc как новый метод генной терапии.

Мышиные клетки линии G8 были получены из Университета МакМастер, Канада. Клетки поддерживали в среде модифицированного Игла Дульбекко (DMEM), дополненной 10 и 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина.

Для трансфекции использовали плазмидную ДНК pFUSE-mIgG1-Fc1. Трансфекцию клеток проводили с использованием реактивов трансфекции TurboFect (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с инструкциями производителей. К 50% конфлюэнтным клеткам, выращиваемые в чашках с крышкой (диаметр=10см) добавлялось предлагаемое количество плазмиды mFc с рецептурой реагентов для трансфекции. Культуральную среду заменяли через 6 часов после трансфекции. Для получения стабильно трансфицированных клеточных линий, клетки разделяли через 1:10 через 24 часа после трансфекции и добавляли соответствующий селективный реагент в клетки. Свежую среду с селективным реагентом добавляли каждые 2 дня. Zeocin (Invivogen, USA) использовали в качестве селективного реагента для Fc-трансфицированных клеток. Подходящие концентрации (600 нг / мл) выбираемого реагента определяли, проводя эксперимент по чувствительности к лекарственным средствам. Отбор селективным реагентом продолжался в течение двух-трех недель, после чего отдельные клоны стабильно трансфицированных клеток получали для трансфицированных mFc клеток с использованием клонирующих цилиндров. Клоны выращивали на 48-луночных и 24-луночных планшетах перед скринингом для секреции с помощью ELISA Quanti-Luc.

Анализ ELISA Quanti-Luc использовали для всех тестов обнаружения белка mFc. 47 потенциальных экспрессирующих mFc клонов были отобраны для скрининга mFc после трансфекции и 2-3-недельного отбора. При скрининге Quanti-Luc для секреции белка Lucia клоны с6, с7, c11, g1, c8, h5 (RLU ~ 14 000 K RLU) были выбраны в качестве потенциальных высоких секреторов, что дает самые высокие показания RLU среди других клонов (рис.1). Скринированные пулы также дали высокие результаты и были заморожены как дополнительные потенциальные секреторы. Данные клоны были выбраны для последующих инкапсуляций для имплантации in vivo в качестве самого высокого клона секретирующего mFc.

Рисунок  SEQ Рисунок \* ARABIC 1. Quanti-Luc результаты клонального отбора Fc-трансфицированных стабильных клеток G8 после 48 часов инкубирования. Показания RLU для 6 скринированных пулов. Контроль – не трансфицированные

Инкапсулирование клеток осуществляли с использованием электростатической капсулирующей машины (Nisco, Zurich, Switzerland), как описано ранее [21]. Клетки собирали и подсчитывали до инкапсулирования, и осадок клеток ресуспендировали в 1-3 мл физиологического раствора. 1,5% раствора стерильного альгината (Improved Kelmar, California) добавляли к клеткам в концентрации 4 мл клеток / мл. Суспензию клеток альгината прокачивают через иглу инкапсулятора, чтобы опустить в 1,1% раствор CaCl2 (7,15кВ, 60 мл/ч). После образования капсул (размером ~ 400 мкм) их инкубировали в 0,05% PLL (6 мин) и в 0,03% альгинате калия (4 мин). Микрокапсулы промывали физиологическим раствором между каждой стадией инкубации и, наконец, бессывороточной DMEM. После инкапсуляции клетки возвращали в обычные условия культивирования. Клетки инкапсулировали с плотностью 5 мл клеток / мл альгината и 1,5 мл капсул культивировали в 9 мл. Как инкапсулированные, так и неинкапсулированные клетки имели положительную экспрессию mFC по сравнению с контрольной (нетрансфекционная клеточная среда). Показания RLU были намного выше для неинкапсулированных клеток, чем для инкапсулированных клеток, потому что у неинкапсулированных клеток было меньше отношение объема к объему / среде по сравнению с инкапсулированной группой (3 * 106 / мл против 2,2 * 106 / мл). Однако концентрация mFc, секретированная на миллион клеток в течение 48 часов, была одинакова в  неинкапсулированных и инкапсулированных клетках, 10 000 000 RLU и 13 000 К RLU.

Экспрессию Lucia анализировали с использованием люминесцентного анализа Quanti-Luc (Invivogen). Для измерения относительных световых единиц (RLU) использовалась длина волны 465-493 нм в Synergy H1 (Biotech).

В ходе исследований мы показали, что рекомбинантные миобласты G8, инкапсулированные в микрокапсулах альгината-PLL, могут успешно секретировать определяемые уровни Fc из капсул и поддерживать хорошую жизнеспособность, показывая потенциал доставки FVIII инкапсулированными клетками. Следующим шагом будет одновременное введение rFVIII и инкапсулированные миобласты, экспрессирующие mFc, в мыши и наблюдение ответной реакции.

Предложенное лечение инкапсулированными секреторными клетками Fc имеет много критических шагов, начиная с конструирования нескольких устойчивых клеточных линий, контролируя концентрацию всех секретируемых белков и достигая правильной экспрессии структуры микрокапсул.

Список литературы:

1. Blankenship, Crystal S. To manage costs of hemophilia, patients need more than clotting factor // Biotechnology healthcare. – 2008. - №5.4. - P. 37.
2. Coppola A., Antonio N. Treatment of hemophilia: a review of current advances and ongoing issues // J Blood Med.  – 2010. №1. - P. 183-95.
3. Cousens, Leslie P. Application of IgG-derived natural Treg epitopes (IgG Tregitopes) to antigen-specific tolerance induction in a murine model of type 1 diabetes // Journal of diabetes research. – 2013. №3. - P. 234-240.
4. Cousens, Leslie P. Tregitope update: mechanism of action parallels IVIg // Autoimmunity reviews. – 2013. №12.3. - P. 436-443.
5. Dargaud, Y. Achievements, challenges and unmet needs for haemophilia patients with inhibitors // Haemophilia. – 2016. № 22. - P. 1-24.
6. De Groot, Anne S. Activation of natural regulatory T cells by IgG Fc–derived peptide “Tregitopes” //  Blood. – 2008. №112.8. - P. 3303-3311.
7. De Vos L., Paul J. Alginate-based microcapsules for immunoisolation of pancreatic islets // Biomaterials. – 2006.  №27.32. - P. 5603-5617.
8. Fay G., Philip J. Factor VIII structure and function // International journal of hematology. – 2006.  Vol. 83.2. - P. 103-108.
9. Lathuilière A., Nicolas M., Bernard L. Schneider. Encapsulated Cellular Implants for Recombinant Protein Delivery and Therapeutic Modulation of the Immune System // International journal of molecular sciences. – 2015. №16.5. - P.105-109.
10. Lenting, Peter J., Jan A. van Mourik, Koen M. The life cycle of coagulation factor VIII in view of its structure and function // Blood.  – 1998. №92.11. - P. 83-96.
11. Lim F., Anthony M. Sun.. Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas // Science. – 1980. №210. - P. 908-910.
12. Pratt, Kathleen P. Engineering less immunogenic and antigenic FVIII proteins. // Cellular immunology. – 2015. №45. – P. 12-18.
13. Schneider D. U,, Stephan F. Long-term graft function of adult rat and human islets encapsulated in novel alginate-based microcapsules after transplantation in immunocompetent diabetic mice // Diabetes.  – 2005.  №54.3. - P. 687-693.
14. Thompson, Arthur R. Structure and function of the factor VIII gene and protein // Seminars in thrombosis and hemostasis. – 2003. - Vol. 29. No. 1. – P.67-76.
15. Witmer C., Guy Y. Factor VIII inhibitors in hemophilia A: rationale and latest evidence // Therapeutic advances in hematology. - 2012.  №20. – P. 201-207.