ОЦЕНКА РОЛИ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ИНДУЦИРОВАНИИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ БАКТЕРИЙ

EVALUATION OF THE ROLE OF ASCORBIC ACID IN THE INDUCTION OF OXIDATIVE STRESS ON LUXURY BACTERIA

Ruslan Gurbanov

Student, Department of Cell Biology, Morphology and Microbiology Chechen State University. A.A. Kadyrov

Russia, Grozny

Petimat Dzhambetova

scientific adviser, Doctor of Biological Sciences, Professor Department of Cell Biology, Morphology and Microbiology, Chechen State University A.A. Kadyrov

Russia, Grozny

АННОТАЦИЯ

Исследование влияния аскорбиновой кислоты на генетический материал и индукцию окислительного стресса на штаммах люминесцентных бактерий E. coli показало негативное воздействие и при более высоких концентрациях бактерицидный эффект.

ABSTRACT

The study of the effect of ascorbic acid on the genetic material and the induction of oxidative stress on strains of luminescent bacteria E. coli showed a negative effect even at higher concentrations of the bactericidal effect.

Ключевые слова: аскорбиновая кислота, E.coli, люминесценция, окислительный стресс.

Keywords: ascorbic acid, E.coli, luminescence, oxidative stress.

Введение. На сегодняшний день при тестировании химических веществ, вызывающих мутагенез и канцерогенез, широко используют бактериальные lux-биосенсоры [1]. Тестирование осуществляется путём индукции биолюминесцентных клеток в присутствие генотоксического/оксидативного вещества. В качестве подобных тест-систем используются искусственно созданные штаммы люминесцирующих бактерий Escherichia coli MG1655, содержащих гибридные плазмиды pColD-lux, pSoxS-lux, pRecA-lux и pKatG-lux. Гибридная плазмида содержит гены luxAB морских бактерий V. flscheri, V. harveyi, Ph. leiognathi и наземных Ph.s luminescens, включающих информацию α и β субъединиц люциферазы, и встраивают векторную плазмиду под индуцируемый промотор, активирующиеся при появлении в среде определенных химических веществ [2]. Так, в работе Eltzov E. с соавторами (2008) были использованы бактерии-биорепортеры, способные люминесцировать после воздействия определенных стрессов [8]. В многочисленных исследованиях показано широкое использование люминесцентных бактерий для определения различных веществ: тяжелые металлы [9], активные формы кислорода [4], фенолы [6] и различные загрязнители окружающей среды [3, 7, 10]. Простота и биологическая значимость тестов бактериальных биорепортеров делает их привлекательными в качестве быстрого и эффективного метода мониторинга присутствия токсичных веществ в образцах воды, воздуха, почвы и пищевых продуктов [11].

Для тестирования в нашей работе выбрана аскорбиновая кислота, широкое использование которой в рационе человека обеспечивает нормальное развитие и функционирование всего организма, являясь сильным антиоксидантом и восстановителем во многих биохимических процессах. Длительный и повышенный приём аптечных форм аскорбиновой кислоты может привести к нарушениям всасывания витамина B12, ухудшению работы почек и откладыванию в них оксалатных камней, повышению мочевой кислоты в моче [3]. При этом необходимо указать, что практически нет данных о возможном негативном влиянии аскорбиновой кислоты генетические процессы в клетках человека.

В связи с чем определена цель данного исследования - первичная оценка возможных рисков при воздействии на молекулы ДНК и индукции оксидативного стресса, вызванного аскорбиновой кислотой.

Методика проведения исследования. В качестве тест-систем для исследования аскорбиновой кислоты были использованы искусственно созданные штаммы люминесцирующих бактерий Escherichia coli MG1655, содержащих гибридные плазмиды pColD-lux, pSoxS-lux, pRecA-lux и pKatG-lux. В качестве положительного контроля были использованы: диоксидин (0,05 мг/мл) для активации промоторов pColD и pRecA; пероксид водорода (0,01 мкг/мл) для активации промоторов pKatG и pSoxS. Штаммы любезно предоставлены проф. Абилевым С.К. (ИОГен им. Н.И.Вавилова, Москва). Для отрицательного контроля, использовалась дистиллированная вода.

Выращивание изучаемых штаммов проводили в течение 10-17 ч в бульоне Лурия-Бертани (LB) (37°С), в состав которого добавили 100 мкг/мл ампициллина. Ночную культуру разводили в свежем бульоне (1 мл ночной культуры к 10 мл свежего бульона) и выращивали при 37°С в течение 2 ч. Затем 180 мкл полученной аликвоты раскапывали в микропланшет и вносили по 20 мкл изучаемого вещества, и отдельно 20 мкл положительного и отрицательного контроля вместе с культурой (180 мкл). Микропланшет с его содержимым культивировали при 37°С и в зависимости от штамма фиксировали данные о люминесценции в определённые промежутки времени: E.coli MG1655 (pColD-lux) -90 мин., E.coli MG1655 (pKatG-lux)- 45 мин., E.coli MG1655 (pSoxS-lux) -60 мин., E.coli MG1655 (pRecA-lux) -60 мин. Показания фиксировались на микропланшетном люминометре - Luminometer photometer LM 01A.

Отношение интенсивности люминесценции культуры lux-биосенсора, содержащей исследуемый препарат (l_ind), к интенсивности люминесценции контрольной культуры lux-биосенсора (l₀) определяется как фактор индукции по формуле: R=l_ind/l₀.

Результаты исследования. Результаты исследования аскорбиновой кислоты с использованием штаммов, специфически реагирующих на мутагенные и канцерогенные вещества представлены в таблице 1. При исследовании, были взяты следующие концентрации аскорбиновой кислоты (мг/мл): 0,851 М; 0,567 М; 0,283 М; 0,170 М; 0,085 М; 0,048 М; 0,024 М; 0,012 М; 0,008 М; 0,006 М. Детальные результаты по данным концентрациям приведены в: табл. 1, рис. 1, рис. 2, рис. 3, рис. 4.

Таблица 1

Исследование влияния аскорбиновой кислоты на оксидативный стресс на биолюминосцентные штаммы E.coli

Достоверность отличия биолюминесценции опытной культуры от контрольной величины оценивали по t-критерию Стьюдента. Статистическое значение составило p<0,001

Результаты исследования аскорбиновой кислоты со штаммами E.coli MG1655 (pKatG-lux) и E.coli MG1655 (pSoxS-lux) показали, что концентрация 0,024 М (рис. 1) является пиковой в индукции люминесценции у E.coli MG1655 (pKatG-lux), а концентрация 0,048 М (рис. 2) пиковой в индукции люминесценции у E.coli MG1655 (pSoxS-lux).

Хотя и есть данные о том, что аскорбиновая кислота является антиоксидантом, ингибирует окисление, но всё же определённые концентрации способны в небольшой степени индуцировать окисление в микробной клетке по сравнению с отрицательным контролем. Концентрации аскорбиновой кислоты в 0,085 М и больше (рис. 1, рис. 2), для двух данных штаммов, оказывают одинаковое бактерицидное воздействие

Рисунок 1. Биолюминесцентный отклик штамма E.coli MG1655 (pKatG-lux) на аскорбиновую кислоту

Рисунок 2. Биолюминесцентный отклик штамма E.coli MG1655 (pSoxS-lux) на аскорбиновую кислоту

Рисунок 3. Биолюминесцентный отклик штамма E.coli MG1655 (pColD-lux)

При изучении штаммов E.coli MG1655 (pColD-lux) и E.coli MG1655 (pRecA-lux), отражающих негативное влияние различных веществ на генетический материал, было показано (рис. 3 и 4), что при концентрации аскорбиновой кислоты в 0,085 М для E.coli MG1655 (pColD-lux) наблюдается пик индукции, а для штамма E.coli MG1655 (pRecA-lux) пик индукции при 0,048 М.

Рисунок 4. Биолюминесцентный отклик штамма E.coli MG1655 (pRecA-lux)

Полученные данные позволяют сделать вывод, что аскорбиновая кислота оказывает незначительное влияние на повреждение структуры молекулы ДНК прокариот. Концентрации в 0,170 М и больше (рис. 3 и 4), обладают бактерицидным воздействием для двух штаммов E.coli MG1655 (pColD-lux) и (pRecA-lux).

Список литературы:

1. Игонина Е.В. Lux-биосенсоры: скрининг биологически активных соединений на генотоксичность. / Игонина Е. В., Марсова М. В., Абилев С. К.// Экологическая генетика, 2016. -№14(4). - С. 52-62.
2. Котова В.Ю Индуцируемые специфические lux-биосенсоры для детекции антибиотиков: конструирование и основные характеристики. / Котова В.Ю, Рыженкова K.B., Манухов И.В  3aвигельский Г.Б. //Прикладная биохимия и микробиология. - 2014. - Т. 50.— № 1. - С. 112-117.
3. Bechor O. Recombinant microorganisms as environmental biosensors: Pollutants detection by Escherichia coli bearing fabA:Lux fusions. / Bechor O., Smulski D.R., Van Dyk T.K., LaRossa R.A., Belkin S.  //J. Biotechnol. 2002. -№94.-P.125–132.
4. Belkin S. Oxidative stress detection with Escherichia coli harboring a katg’: Lux fusion. / Belkin S., Smulski D.R., Vollmer A.C., Van Dyk T.K., LaRossa R.A.  //Appl. Environ. Microbiol. 1996. -№62.-P.2252–2256.
5. Carr AC. Vitamin C and Immune Function. / Carr AC, Maggini S. //Nutrients. 2017. - №9(11). – Р.1211.
6. Choi S.H. A portable toxicity biosensor using freeze-dried recombinant bioluminescent bacteria. /Choi S.H., Gu M.B. //Biosens. Bioelectron. 2002. -№17.-P.433–440.
7. Durand M.J. Specific detection of organotin compounds with a recombinant luminescent bacterium. /Durand M.J., Thouand G., Dancheva-Ivanova T., Vachon P., DuBow M. //Chemosphere. 2003. -№52. - P.103–111.
8. Eltzov E. Detection of sub-inhibitory antibiotic concentrations via luminescent sensing bacteria and prediction of their mode of action. /Eltzov E., Ben-Yosef D.Z., Kushmaro A. // Sen. Actuators B Chem. 2008. -№129.-P.685–692.
9. Ivask A. Fibre-optic bacterial biosensors and their application for the analysis of bioavailable hg and as in soils and sediments from aznalcollar mining area in spain. / Ivask A., Green T., Polyak B., Mor A., Kahru A., Virta M., Marks R. //Biosens. Bioelectron, 2007. - №22.-P.1396–1402.
10. Polyak B. Synthesis and characterization of a biotin-alginate conjugate and its application in a biosensor construction. / Polyak B., Geresh S., Marks R.S. //Biomacromolecules. 2004. - №5. - P.389–396.
11. Van der Meer J.R. Where microbiology meets microengineering: Design and applications of reporter bacteria. / Van der Meer J.R., Belkin S. //Nat. Rev. Microbiol. 2010. - №8.-P.511–522.