Статья опубликована в рамках: Научного журнала «Студенческий» № 16(144)
Рубрика журнала: Технические науки
Секция: Биотехнологии
Скачать книгу(-и): скачать журнал часть 1, скачать журнал часть 2, скачать журнал часть 3, скачать журнал часть 4, скачать журнал часть 5, скачать журнал часть 6
ОПТИМИЗАЦИЯ ПАРАМЕТРОВ ИНКУБАЦИИ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ШТАММА A/VICTORIA/2570/2019 (H1N1) ВИРУСА ГРИППА НА КУРИНЫХ ЭМБРИОНАХ
АННОТАЦИЯ
В статье представлены экспериментальные данные по изучению параметров культивирования штамма A/Victoria/2570/2019 (H1N1) вируса гриппа на куриных эмбрионах для изготовления вакцины.
Ключевые слова: вирус гриппа, культивирование вирусов, вакцина.
Введение
В настоящее время грипп является актуальной проблемой для всего человечества, занимая первое место по частоте и количеству случаев заболевания. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) считает, что единственным эффективным методом профилактики гриппа является массовая вакцинация населения [2].
Ежегодно Глобальная система эпиднадзора за гриппом (GISRS), регулируемая ВОЗ, подаёт сведения о заболеваемости. На основании этих сведений ВОЗ даёт рекомендации по штаммовому составу вакцин на следующий эпидемиологический сезон, а также предоставляет новые образцы штаммов вируса гриппа [1].
Для производства гриппозных вакцин нового поколения используются вирус гриппа типа A (подтипы A(H1N1) и A(H3N2)) и тип B (линии Yamagata и линии Victoria). Задачей биотехнологов на производстве гриппозных вакцин является оптимизация параметров культивирования вируса гриппа с целью увеличения выхода биомассы.
По данным ВОЗ на 2021 год одним из актуальных штаммов вируса гриппа типа A является A/Victoria/2570/2019 (H1N1).
Материалы и методы
Исследование проводилось на базе Биофармацевтической компании ООО «ФОРТ» в период с 1 марта по 10 марта 2021 года.
Для проведения исследования был взят штамм вируса гриппа типа A подтип A/Victoria/2570/2019 (H1N1). Образец штамма был предоставлен ВОЗ и рекомендован для производства гриппозной вакцины на 2021 год.
Использовались куриные эмбрионы в возрасте 9-15 суток, полученные с 1-ой Минской птицефабрики.
В ходе исследования было поставлено 4 опыта по определению четырех параметров инкубации при культивировании штамма A/Victoria/2570/2019 (H1N1) вируса гриппа на куриных эмбрионах: опыт 1 - температура, опыт 2 - влажность, опыт 3 - время инкубации и опыт 4 - возраст куриных эмбрионов.
Для опытов 1 и 4 заражение куриных эмбрионов проводили в аллантоисную жидкость на автоматической линии заражения.
Для опытов 2 и 3 заражение куриных эмбрионов проводили в аллантоисную жидкость по стандартной методике. Яйцо помещали в штатив, тупым концом вверх. Делали отверстие в скорлупе и вводили вертикально тонкую иглу на глубину 10-12 мм и заражали вируссодержащим материалом куриный эмбрион.
Зараженные куриные эмбрионы помещались в лотки и отправлялись на инкубацию в термальные камеры.
После инкубации куриные эмбрионы в опытах 1 и 4 проходили овоскопирование и отправлялись на автоматическую линию по сбору вируссодержащей аллантоисной жидкости. Далее проводилась инактивация вируса. И после стадий сепарирования, микро- и ультрафильтрации и центрифугирования определяли выход вирусного белка в сахарном вирусном концентрате.
В опыте 2 извлекали аллантоисную жидкость с помощью дозатора и наконечника в пробирку и градацией (мл). Объем аллантоисной жидкости является результатом опыта.
В опытах 3 после инкубации определяли жизнеспособность куриных эмбрионов с помощью овоскопирования и вскрытия [3].
Результаты и обсуждение
Опыт 1. Определение оптимальной температуры инкубации КЭ при культивировании штамма A/Victoria/2570/2019 (H1N1) вируса гриппа.
Для опыта 1 было взято 12 серий куриных эмбрионов, по 36 штук в каждой серии. После заражения, куриные эмбрионы помещались в термальные камеры, и устанавливалась температура инкубации. Результаты опыта представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Определение оптимальной температуры инкубации КЭ
|
№ серии |
Температура инкубации, °C |
Выход вирусного белка с 1 КЭ, мкг |
|
1 |
36 |
17,3 |
|
2 |
36 |
25,4 |
|
3 |
36 |
24,2 |
|
4 |
35 |
24,2 |
|
5 |
35 |
29,6 |
|
6 |
35 |
28,9 |
|
7 |
34 |
32,3 |
|
8 |
34 |
33,1 |
|
9 |
34 |
29,8 |
|
10 |
33 |
34,4 |
|
11 |
33 |
37,1 |
|
12 |
33 |
36,6 |
При снижении температуры с 36°C до 33°C выход вирусного белка увеличивается. Ниже 33°C вирус гриппа не культивируется.
Опыт 2. Определение оптимальной влажности инкубации КЭ при культивировании штамма A/Victoria/2570/2019 (H1N1) вируса гриппа.
Для опыта 2 было взято 9 серий куриных эмбрионов, по 20 штук в каждой серии. После заражения, куриные эмбрионы помещались в термальные камеры, и устанавливалась влажность инкубации. Результаты опыта представлены в таблице 2.
Таблица 2.
Определение оптимальной влажности инкубации КЭ
|
№ серии |
Влажность инкубации, % |
Объем аллантоисной жидкости, мл |
|
1 |
55±2 |
6,7 |
|
2 |
55±2 |
7,1 |
|
3 |
55±2 |
6,9 |
|
4 |
65±2 |
8,3 |
|
5 |
65±2 |
8,9 |
|
6 |
65±2 |
9,2 |
|
7 |
70±2 |
7,5 |
|
8 |
70±2 |
7,8 |
|
9 |
70±2 |
7,9 |
При повышении влажности с 55±2% до 65±2% объем аллантоисной жидкости увеличивается. При дальнейшем ее увеличении объем аллантоистой жидкости падает.
Опыт 3. Определение оптимального времени инкубации КЭ при культивировании штамма A/Victoria/2570/2019 (H1N1) вируса гриппа.
Для опыта 3 было взято также 9 серий куриных эмбрионов, по 20 штук в каждой серии. Результаты опыта представлены в таблице 3.
Таблица 3.
Определение оптимального времени инкубации КЭ
|
№ серии |
Время инкубации, ч |
Гибель КЭ, % |
|
1 |
24 |
4,5 |
|
2 |
24 |
5,6 |
|
3 |
24 |
5,1 |
|
4 |
48 |
9,6 |
|
5 |
48 |
11,0 |
|
6 |
48 |
13,1 |
|
7 |
72 |
24,2 |
|
8 |
72 |
31,4 |
|
9 |
72 |
35,0 |
При увеличении времени инкубации с 24 часов до 72 часов процент гибели КЭ увеличивается.
Опыт 4. Определение оптимального возраста КЭ для культивирования штамма A/Victoria/2570/2019 (H1N1) вируса гриппа.
Для опыта 4 было взято 21 серия куриных эмбрионов, по 36 штук в каждой серии. Результаты опыта представлены в таблице 4.
Таблица 4.
Определение оптимального возраста КЭ для культивирования вируса гриппа
|
№ серии |
Возраст КЭ, сутки |
Выход вирусного белка с 1 КЭ, мкг |
|
1 |
9 |
15,6 |
|
2 |
9 |
17,2 |
|
3 |
9 |
19,1 |
|
4 |
10 |
28,4 |
|
5 |
10 |
30,2 |
|
6 |
10 |
34,2 |
|
7 |
11 |
45,7 |
|
8 |
11 |
44,2 |
|
9 |
11 |
49,1 |
|
10 |
12 |
62,4 |
|
11 |
12 |
65,3 |
|
12 |
12 |
64,3 |
|
13 |
13 |
67,5 |
|
14 |
13 |
69,8 |
|
15 |
13 |
59,7 |
|
16 |
14 |
55,4 |
|
17 |
14 |
59,1 |
|
18 |
14 |
57,6 |
|
19 |
15 |
51,4 |
|
20 |
15 |
50,9 |
|
21 |
15 |
48,0 |
При увеличении возраста КЭ с 9 суток до 13 суток выход вирусного белка увеличивается. А при дальнейшем увеличении возраста КЭ выход вирусного белка снижается.
Вывод
В ходе исследования были установлены оптимальные параметры инкубации при культивировании вируса штамма A/Victoria/2570/2019 (H1N1) вируса гриппа на куриных эмбрионах. Для производства гриппозной вакцины данный штамм рекомендуется культивировать при температуре 33°C и влажности 65±2% в течение 24 часов, и возраст куриных эмбрионов должен составлять 13 суток.
Благодарность
Автор выражает благодарность своему научному руководителю канд. биол. наук, доц. Кругловой Алле Петровне за советы и рекомендации при планировании и написании данной рукописи, а также начальнику цеха производства вакцин ООО «ФОРТ» Куликову Алексею Викторовичу за предоставленный опыт и оказанную помощь при проведении исследования, а также за важнейшие замечания по оформлению настоящей статьи.
Список литературы:
- Глобальная система эпиднадзора за гриппом и реагирования на него (GISRS): [Электронный ресурс]. Режим доступа: https://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/en/ (Дата обращения: 11.04.2021).
- Кошина О. С., Еровеева М. К., Никифорова А. Н., Максакова В. Л. Вакцинопрофилактика гриппа в современных условиях // Медицинский совет. - 2016. - №07. - С. 86-89.
- Строганова И. Я. Куриные эмбрионы и их использование в вирусологии: метод. указания к лабораторным занятиям / Краснояр. гос. аграр. ун-т. - Красноярск, 2013. - 19 с.
Оставить комментарий