ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИМИКРОБНЫХ И АНТИОКСИДАНТНЫХ СВОЙСТВ РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСТРАКТОВ

В последние годы большое внимание уделяется традиционной медицине, которая предполагает использование для лечения экстрактов растений или их активных компонентов. Необходимо отметить, что флора Казахстана широко представлена растениями, содержащими флавоноиды. Флавоноиды – большая группа фенольных соединений, широко представленная в растительном мире [3, с. 5; 4, с. 248; 9, с. 235]. Растительные полифенолы оказывают разнообразные биоло­гические эффекты на многочисленные клеточные системы как in vitro так и in vivo [13, с. 137]. Для многих флавоноидов установлено антиоксидантное, противомикробное, противовоспалительное, противораковое действие [7, с. 1245; 6, с. 1277; 10, с. 234], что обусловило широкое применение флавоноидсодержащего растительного сырья для производства лечебных и профилактических средств.  Кроме того, полифенолы, которые составляют активную субстанцию, обнаружены во многих лекарственных растениях, модулируют активность широкого диапазона клеточных ферментов и рецепторов. Признание антиоксидантных свойств полифенолов, их большое изобилие в нашей пище, и их роль в предотвращении различных болезней, связанных с окислительным стрессом, таких как рак, сердечно-сосудистые и нейродегенеративные болезни являются основной причиной неугасающего интереса к данным соединениям. В дополнение есть много данных об антибактериальных свойствах полифенольных соединений [2, с. 564; 8, с. 1002; 5, с. 462].

Целью наших исследований явилось оценка антиоксидантных и антимикробных свойств водно-этанольных экстрактов растений обладающих противовоспалительным и антисептическим действием представленных в отечественной фармакопее.

Методы исследования

Для приготовления экстракта исследованных растений использовали 50% спирт, соотношение сухого вещества и экстрагента 1/10, экстракцию проводили в течение 20 часов. По окончанию времени экстрагирования экстракт отфильтровывали для очистки от крупных частиц. Готовые фитоэкстракты хранили в холодильнике при температуре 4°С. Водно-этанольные экстракты лекарственных растений в дальнейшем использовали для исследования их антиоксидантных свойств по влиянию на процессы перекисного окисления в микросомах печени.

Для достижения поставленной цели и решения задач использовали следующие методы: для получения гомогената навеску 0,5-1,0 г  ткани печени крыс  после промывания в охлажденном физиологическом растворе помещали в 5-10 мл среды, содержащей 0,85% NaCl и 50мМ КН₂РО₄, (рН 7,4 при 4°С) и гомогенизировали гомогенизатором типа Polytron в течение 90 сек. Гомогенат центрифугировали при 10000g в течение 20 мин. Микросомную фракцию получали, центрифугируя супернатант при 30000g в течение 60 мин. Надосадочную жидкость осторожно сливали и осадок, представляющий собой микросомальную фракцию, сус­пендировали в среде, содержащей 25% глицерина, 0.1 мМ ЭДТА, 0.2 мМ СаСl₂, 10 мМ гистидина, (рН 7.2 при 4°С) и хранили при минус 4°С.

Об интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) в микросомах печени судили по содержанию ТБК-активных продуктов. Концентрацию малонового диальдегида (МДА) определяли по интенсивности развивающейся окраски в результате взаимодействия с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) по методу Н.О. Ohkawa e.a. [12, с. 353]. За накоплением малонового диальдегида (МДА) - продукта ПОЛ, следили по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой, оптическую плотность измеряли при 532 нм. Расчет содержания продуктов, реагирующих с ТБК, проводили с учетом коэффициента молярной экстинкции МДА, равного 1.56´10⁵ М^-1×см^-1.

Определение антибактериальной активности  проводили методом  серийных  разведений препаратов в питательной среде: мясо-пептонном бульоне, МПБ (для Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus и др.) и жидкой среде Сабуро (для Candida albicans). Рабочий раствор антибактериального препарата (АБП) готовили из основного раствора с использованием жидкой питательной среды. Концентрация рабочего раствора каждого фитопрепарата составила 10 мкг/мл. Для инокуляции использовали стандартную микробную взвесь, разведенную в 100 раз на питательном бульоне. По 0,5 мл инокулюма вносили в каждую пробирку, содержащую по 4,5 мл соответствующего разведения АБП, и в одну с 4,5 мл питательного бульона без исследуемого вещества («отрицательный» контроль). Инокулюм вносили в пробирки с разведениями АБП не позднее 15-30 мин с момента приготовления. Для инкубации пробирки закрывали стерильными ватно-марлевыми пробками и инкубировали в обычной атмосфере при температуре 37 ̊С в течение 20-24 ч. Для определения наличия роста микроорганизма пробирки с посевами просматривали в проходящем свете. Рост культуры в присутствии АБП сравнивали с пробиркой «контроль исследуемого вещества», не содержащую исходный инокулюм. МПК (минимально подавляющая концентрация) определяли по наименьшей концентрации АБП, которая подавляет видимый рост микроорганизма.

Статистическая обработка данных. Результаты статистически обрабатывали с использованием программы Microsoft Excel и GraphPad Prism 5,01. С учетом критерия Фишера-Стьюдента зарегистрированные изменения показателей считали достоверными при р£ 0,05.

Результаты исследований и их обсуждение

Для выполнения поставленной цели были исследованы антиоксидантные свойства спиртовых экстрактов листьев облепихи, шиповника, почек березы, трав мать и мачехи, мяты обыкновенной, душицы, корня копеечника забытого (красного корня) в условиях in vitro и определены концентрации экстрактов, вызывающие пятидесятипроцентное ингибирование ПОЛ (IC₅₀).

Как видно из таблицы 1 все исследуемые экстракты обладают дозозависимым антиоксидантным действием, тем не менее, следует отметить, что экстракты мать и мачехи и душицы обыкновенной оказались менее эффективными по сравнению с другими экстрактами.

Таблица 1

Исследование антиоксидантных свойств экстрактов лекарственных растений.

Для более детального исследования антикосидантных свойств растительных экстрактов были проведены эксперименты с диапазоном концентраций от 0-20 мкг. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2

Исследование антиоксидантных свойств экстрактов лекарственных растений.

Как видно из таблицы 2, при влиянии концентрации до 10 мкг водно-этанольного экстракта травы мать и мачехи отмечается повышение уровня процессов ПОЛ до 52,5 %, однако увеличение концентраций привело к снижению прооксидантного эффекта, антиоксидантное действие экстракта проявилось при действии концентрации свыше 20мкг. Действие экстракта в концентрации 15 мкг оказалось неэффективным и не оказывало ингибирующего влияния на перекисные процессы. При исследовании противоокислительных свойств экстракта душицы обыкновенной выявлено, что при концентрации 5 мкг названный экстракт не оказывает подавляющего действия на процесс накопления МДА. Повышение концентрации привело к плавному снижению уровня продуктов ПОЛ. Согласно данным полученных в ходе оценки антиоксидантных свойств экстракта шалфея, названный экстракт обладает малозначительными антиоксидантными свойствами при концентрации 5 мкг, уровень ПОЛ снизился на 14,6%. Однако, при действии концентрации 10 мкг, интенсивность перекисного окисления снизилась на 74,5 %, при концентрации 15 мкг – на 84,9 %, 20 мкг – на 86,4 %. Исследование листьев шиповника выявило, что названный экстракт обладает дозозависимым противоокислительным действием, уровень накопления ТБК-активных продуктов снижался на 27,5 % при действии концентрации 5 мкг, на 56,8 % при 10 мкг, на 77,8 % при действии 15 мкг, дальнейшее увеличение концентрации не приводило к значительному снижению процессов ПОЛ. Исследование экстракта мяты перечной показало, что при концентрации 5 мкг растительный экстракт обладает достаточно выраженным свойством ингибировать накопление продуктов липопероксидации, уровень ПОЛ составил 52,9 %, при 10 мкг уровень ПОЛ не превышал 30% относительно контроля, при 15 мкг – 20,5 %, при действии концентраций 20 мкг содержание ТБК-активных составило не более 15 %.

Экстракт копеечника забытого практически полностью ингибировал процесс образования МДА при концентрации от 15 мкг, тогда как при действии 5 мкг антиоксидантный эффект экстракта был схожим с действием экстракта мяты и при действии 10 мкг – экстракта листьев шиповника. Исследование экстрактов листьев облепихи обладают выраженным действием на интенсивность перекисных процессов по сравнению с другими исследованными образцами. При действии 5 мкг уровень ПОЛ снизился на 56,5%, при 10 мкг – 71,5% и от 15 мкг на 85-90 %.

В результате экспериментов выявлено, что все экстракты оказывают дозозависимый антиоксидантный эффект. Необходимо отметить, что тотальное ингибирующее действие экстрактов на процессы ПОЛ в микросомах печени проявлялось в концентрациях от 50 мкг, кроме экстрактов мать и мачехи и душицы обыкновенной.

Анализируя полученные результаты, для каждого экстракта определена 50%-ная ингибирующяя концентрация,  т.е. IC₅₀ (таблица 3)

Таблица 3

Значения IC₅₀ растительных экстрактов

Серия работ по определению антибактериальной активности растительных экстрактов проведена на базе миробиологической лаборатории национального научного медицинского центра (г.Астана).

Для испытания растительных экстрактов на антимикробную активность по отношению к свежевыделенным клиническим штаммам патогенных и условно-патогенных бактерий были использованы экстракты 3-х растений, которые показали наилучшие результаты при определении антиоксидантной активности.

Из взятых в опыт микроорганизмов патогенными являются Salmonella typhimurium и Staphylococcus aureus. Все остальные микроорганизмы являются условно-патогенными штаммами.          Acinetobacter baumannii и Pseudomonas aeruginosa являются госпитальными штаммами с высокой резистентностью к антибактериальным препаратам и факторами патогенности. Они являются основными возбудителями внутрибольничных инфекций в отделениях хирургического, урологического профиля и отделений реанимации

Результаты проведенных испытаний антибактериальной активности исследуемых препаратов приведены в таблицах 4-6.

Таблица 4.

Антибактериальная активность препарата «Трава мяты» по отношению к свежевыделенным клиническим штаммам микроорганизмов.

Таблица 5

Антибактериальная активность препарата «Корни копеечника» по отношению к свежевыделенным клиническим штаммам микроорганизмов.

Таблица 6

Антибактериальная активность препарата «Листья облепихи» по отношению к свежевыделенным клиническим штаммам микроорганизмов.

Как видно из таблиц 1-3, все исследованные фитопрепараты в разведении 10^-1 степени проявляют антибактериальную активность ко всем клиническим штаммам микроорганизмов. Дальнейшее разведение фитоэкстрактов не оказывает влияния на рост бактерий. Следует отметить, что антибактериальная активность препарата «Листья облепихи» в разведении 10^-1 степени проявилась по отношению к свежевыделенным клиническим штаммам грамположительных микроорганизмов Bacillus spp., Enterobacter amnigenus, Staphylococcus aureus,  Staphylococcus epidermidis, грибам рода Candida, а также по отношению к грамотрицательным бактериям вида Salmonella typhimurium и Pseudomonas aeruginosa. Данная концентрация препарата по отношению к граммотрицательным бактериям, Acinetobacter baumannii и E.coli была менее эффективна и был отмечен слабый рост интенсивностью в один +. Остальные разведения препарата не оказывали антибактериального действия. Сравнение антибактериальной активности всех исследованных растительных экстрактов показало, что препарат «Листья облепихи» при разведении 10^-1 степени подавляет рост практически всех исследованных свежевыделенных штаммов микроорганизмов.

Таким образом, в результате исследований выявлено, что практически все экстракты обладают дозозависимым антиоксидантным действием, данный эффект начинает проявляться в концентрации от 5 мкг, за исключением экстрактов душицы и мать и мачехи. Экстракт мать и мачехи оказывает прооксидантный эффект в диапазоне концентраций 5-10 мкг. Наиболее выраженным противоокислительным свойством обладают экстракты копеечника забытого, мяты перечной, листьев облепихи, что видно из значений показателя IC₅₀. При оценке антибактериальных свойств исследованных экстрактов были получены результаты, на основании которых можно заключить, что экстракты мяты обладают менее выраженным антимикробным действием по сравнению с экстрактом копеечника и облепихи. Следует отметить, что экстракты проявляли антибактериальное действие в разведении 10^-1 степени, при дальнейшем разведении подавляющей активности экстрактов в отношении исследуемой микрофлоры не отмечалось.

Химические структуры антибактериальных соединений весьма разнообразны. Имеются данные, что большинство растений содержит несколько компонентов с антибактериальными свойствами для защиты от агрессивных агентов, особенно микроорганизмов. Вещества, имеющие форму гликозидов, не действуют in vitro на микроорганизмы или действуют лишь в очень больших концентрациях. Фенольные агликоны и вещества, не связанные с сахарами, как правило, более активны, хотя антимикробная активность и этих веществ, в большинстве случаев, проявляется в концентрациях, значительно превышающих активные концентрации общепринятых антибиотиков [1, с. 184; 11, с. 17668]. Механизм защитного действия объясняется генерацией большого количества продуктов окисления фенольных соединений, отличающихся высокой реактивностью и токсичностью для болезнетворных микроорганизмов. Защитные свойства флавоноидов и их окисленных производных проявляются не только при патогенной инвазии. Фенольные соединения участвуют в утилизации избытка активных форм кислорода [13, с. 139]. При анализе данных наших исследований по выявлению антимикробных свойств растительных экстрактов и литературы можно заключить, что экстракты копеечника, мяты и листьев облепихи содержат в своем составе флавоноиды в виде гликозидов, которые обладают выраженной антиоксидантной активностью.

Список литературы:

1. Залепуха С. И. Антимикробные свойства растений, употребляемых в пищу // Киев, Наукова думка.- 1973.-191 с.
2. Немерешина О.Н., Гусев Н.Ф., Филиппова А.В., Сычева М.В. Антимикробные свойства сухих экстрактов из сырья видов рода Veronica L. // Успехи современного естествознания. – 2012. – № 8. – С. 54-58.
3. Рахимов К.Д., Сатыбалдиева Ж.А., Суходоева Г.С. и др. Руководство по работе с лекарственными растениями под ред. Беклемишева Н.Д.  – //Алматы: ЗГКП «Дари-Дармек». – 1999. – 232 c.
4. Шульпекова Ю.О. Флавоноиды расторопши пятнистой // Русский медицинский журнал. – 2004. – Т.12, № 5. – С. 248–251
5. Ahmed SI, Hayat MQ, Tahir M, Mansoor Q, Ismail M, Keck K, Bates RB. Pharmacologically active flavonoids from the anticancer, antioxidant and antimicrobial extracts of Cassia angustifolia Vahl.// BMC Complement Altern Med. -2016.- Vol.16 -№1.-Р:460-470
6. Chen G, Li X, Saleri F, Guo M. Analysis of Flavonoids in Rhamnus davurica and Its Antiproliferative Activities // Molecules.-2016.- Vol.21.- №10.-Р: 1275-1282
7. Chun O.K., Chung S. J. and Song W.O. Estimated Dietary Flavonoid Intake and Major Food Sources of U.S. Adults //American Society for Nutrition J. Nutr. – 2007. – Vol.137, № 5. – P.1244-1252
8. Crozier A., Jaganath I.B., Clifford M.N. Dietary phenolics: chemistry, bioavailability and effects on health // Nat. Prod. Rep. – 2009. – Vol. 26, № 8. – P.1001-1043.
9. Landis-Piwowar K.R., Dou Q.P. Polyphenols: biological activities, molecular targets, and the effect of methylation // Curr. Mol. Pharmacol. – 2008. – Vol. 1, № 3. – P.233-243
10. Ko-Chung Tsui , Tzu-Hsuan Chiang , Jinn-Shyan Wang , Li-Ju Lin , Wei-Chih Chao Flavonoids from Gynostemma pentaphyllum Exhibit Differential Induction of Cell Cycle Arrest in H460 and A549 Cancer Cells//Molecules-2014.- Vol. 19.-Р: 17663-17681
11. Ohkawa H.O., Ohishi N., Yagi K. Assay for lipid peroxides in ani­mal tissues by thiobarbituric acid reaction //Anal.Biochem. - 1979. - Vol. 95. - N 2. - P.351-358.
12. Ovaskainen M.L., Torronen R., Koponen J.M. et al. Dietary Intake and Major Food Sources of Polyphenols in Finnish Adults // J. Nutr. – 2008. – Vol. 138, № 3. – P.562 - 566.
13. Silva NCC; Fernandes Júnior A Biological properties of medicinal plants: a review of their antimicrobial activity //Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases.-2010.- vol.16.-№3.-Р: 135-149.