Изучение взаимосвязи структуры флавоноидов и их гепатозащитной активности в условиях экспериментальной гелиотриновой гепатотоксемии

Флавоноиды чрезвычайно широко распространены в растительном мире. Эти соединения интересны своей крайне разнообразной биологической активностью. Для них характерно капилляроукрепляющее, противовоспалительное, антиаллергическое, антитоксическое, иммунотропное  и целый ряд других действий, ориентируясь на которые созданы многочисленные флавоноидсодержащие препараты. Некоторые из этих препаратов нашли применение при лечении токсических и вирусных поражений печени, что представляется особенно важным в виду широкого распространения заболеваний гепато-билиарной системы во всем мире [1,2,3,4]. Вместе с тем, до сих пор не были достаточно четко определены структурные особенности строения флавоноидов, ориентируясь на которые можно было бы в дальнейшем создавать препараты, отвечающие в полной мере требованиям клиницистов в плане наиболее эффективного лечения нарушенного метаболически – функционального состояния печени. Учитывая это, в данной работе была изучена возможность флавоноидов различного химического строения на наличие и выраженность гепатозащитного действия у животных с гелиотриновым поражением печени. Известно, что уже в первые сутки  после введения этого гепатотоксина в печени морфологически обнаруживаются нарушения кровообращения, повышение сосудисто – тканевой  проницаемости и микроциркуляции, угнетение дыхания, нарушение метаболизма гепатоцитов, некроз, явления белково-вакуольной дистрофии  [5].  Поэтому в случае, обнаружения у исследуемые вещества способности предотвращать  нарушения функции гепатоцитов, которые начинают развиваться в условиях острой гелиотриновой гепатотоксемии уже в первые сутки после введения данного токсиканта, позволило бы рассматривать их в качестве потенциальных  гепатопротекторов и использовать при создании новых эффективных лечебных средств для практической гепатологии.

Материалы и методы

В проведенных экспериментах использовали флавоноиды (изофлавоны, флавоны, флавонолы, флаваноны), выделенные из растений центрально- азиатского региона (некоторые получены путем  химической модификации).

Рисунок. Структурные формулы различных групп флавоноидов

В ряду изофлавоноидов были изучены оробол (R₁=R₄=H, R₂=R₃=OH), выделенный из Thermopsis dolichocarpa V. Nikitin  [6], генистин  (R₁ = β –D- Glc, R₂=OH, R₃= R₄=H) – из Thermopsis  alterniflora Rgl. et Schmalh [7 ], формононетин (R₁= R₂=R₃=Н, R₄₌CH₃), ононин (R₁ = β –D- Glc, R₂= R₃=H,  R₄= СH₃)  и биоханин А  (R₁=R₃=H, R₂=OH,  R₄ =CH₃) из Cicer mogoltavicum A. Korov  [8]. В ряду флавонов рассматривались лютеолин  (R₁= R₂=R₄= H,  R₃=OH) и цинарозид (R₁= R₄=Н, R₂ = β –D- Glc, R₃= OH), выделенные из  Ferula varia (Schrenk.) Trautv [9], хризоэриол  (R₁=R₂= R₄ =H, R₃=OСH₃) и термопсозид (R₁= R₄ =H, R₂ = β –D- Glc, R₃=OСH₃) – из Thermopsis alterniflora Rgl. еt Schmalh [7], а также гиспидулин (R₁= OСH₃, R₂ =R₃= R₄= H) из Saussurea elegans L.deb. [10].

Довольно большое количество веществ флавоноидной структуры было исследовано в группе флавонолов.  Это рутин (R₁ = β –D- Glc-α – L-Rha, R₂=R₃= R₄ = R₇= H,  R₅=R₆=OH), выделенный из Lagonychium farctum (Banks et Soland) Bobr. и полученный из него путем гидролиза кверцетин (R₁= R₂= R₃=R₄=R₇=H,  R₅= R₆=OH) [11]. Из данного растения  также выделены мирицетин  (R₁= R₂= R₃=R₄=H,  R₅= R₆= R₇=OH) и мирицетин -3-глюкозид (R₁ = β –D- Glc, R₂=R₃= R₄=H, R₅= R₆= R₇₌OH). Лимоцитрин (R₁=R₂= R₄=R₇=H,  R₃=R₅=OCH₃, R₆=OH) и хаплозид С  (R₁= R₄=R₇=H,  R₂= β –D- (6 – ОAc) – Glc – α – L- Rha,  R₃=R₅=OСH₃, R₆=OH) выделены из Haplophyllum perforatum (M.B.) Kar. Et Kir. [12], галангин (R₁=R₂=R₃=R₄=R₅=R₆=R₇=H) из Glycyrrhiza glabra L. [13], изорамнетин (R₁=R₂= R₃=R₄=R₇=H, R₅= OСH_3, R₆=OH) получен путем гидролиза изорамнетина -3 –O- глюкозида [14]. Также к этой группе может быть отнесено синтетическое соединение – морин (R₁=R₂=R₃=R₅= R₇=H, R₄= R₆=OH) [15 ].

Изученные флаваноны были представлены  пиноцембрином (R₁=OH, R₂=R₃=R₄= R₅=R₆=R₇=H), глабранином (R₁=OH, R₂=R₃=R₅=R₆=R₇=H, R₄=Pr*), изоглабранином (R₁=OH, R₃=R₄=R₅=R₆=R₇=H, R₂=Pr*), выделенными из  Glycyrrhiza glabra L. [13], а также изобавахином (R₁=R₂= R₃= R₅=R₆=H, R₄= Pr*, R₇=OH), глабролом (R₁=R₂=R₃=R₅=H, R₄=R₆=Pr*, R₇=OH), и вексибинолом (R₁=R₅=R₇=OH, R₂=R₃=R₆=H, R₄=Lav**), выделенными из Vexibia alopecuroides (L.) Yakov L. [16]. К этой же группе относится и исследованный нами леманин (R₁=R₂=R₃=R₆=H, R₄= Lav**, R₅=R₇=OH) из Ammothamnus lehmannii Bunge [17] (значком Pr*  обозначена структура: , а Lav** структура: ).

Опыты проведены на мышах-самцах (18–20 г). Примененный в качестве гепатотоксина алкалоид гелиотрин вводили однократно подкожно в дозе 300 мг/кг. Все флавоноиды вводили орально в дозе 50 мг/кг в течение предшествующих 6 дней, а затем на 7-ой день одновременно с гелиотрином. Через 24 часа мышей декапитировали под легким эфирным наркозом. Для оценки гепатозащитного действия исследуемых флавоноидов в сыворотке крови животных определяли содержание фермента аланинаминотрансферазы (АлАТ), а также в печени содержание гликогена и малонового диальдегида (МДА) как описанию в [18]. У части мышей определяли также антитоксическую функцию печени по тесту гексеналового сна. Этот тест является интегральным отражением функций оксидаз печени, так как его биотрансформация осуществляется только  в этом органе [19]. В данном случае после семикратного введения флавоноидов и через сутки после введения гелиотрина животным инъецировали внутрибрюшинно гексенал в дозе 100 мг/кг. Длительность гексеналового сна определялась по времени нахождения животных в боковом положении. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием t – критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Из приведенной таблицы видно, что инъекции мышам  гепатотоксичного алкалоида  гелиотрина в условиях нашего опыта уже через сутки способствовало развитию цитолиза гепатоцитов на что указывало увеличение АлАТ (по отношению к контролю) на 267,5%. Это могло быть во многом обусловлено усилением процессов перекисного окисления липидов, так как концентрация одного из конечных его продуктов – МДА в печени возрастала  на 236,0%. На ухудшение  обменных процессов  в этом случае указывало уменьшение в печени гликогена (на 73,4%), а на снижение антитоксической функции печени увеличение на 117,8% продолжительности гексеналового сна.

Предшествующее же введение животным большинства из исследуемых флавоноидов во многом предотвращало эти негативные сдвиги в метаболически – функциональном состоянии печени, хотя по выраженности гепатозащитного эффекта их действие было далеко не однозначным. В ряду изучаемых изофлавонов выделялся своей  способностью противостоять токсическому действию гелиотрина только оробол. Это видно по всем исследуемым показателям. Так его предварительное введение приводило к тому, что активность АлАТ возрастала только на 92,5% (ниже соответствующего контроля на 47,6%), а содержание гликогена в печени понижалось  всего на 27,9% и было выше контроля на 171,5%. Содержание МДА в печени  возрастало на 90,7% (меньше, чем у животных, получавших гелиотрин на 43,2%), а продолжительность гексеналового сна увеличивалась  только на 54,9% (была меньше, чем в контроле, на 28,9%). Остальные соединения этой группы проявляли слабое гепатозащитное действие. По-видимому наличие в структуре оробола четырех гидроксильных групп (в кольце В две орто расположенные), отсутствие метоксильных групп и углеводных компонентов обеспечивало этому соединению наличие достаточно выраженного гепатозащитного эффекта.

Определенная схожесть в этом отношении была отмечена  и в ряду флавонов. Весьма близкую к ораболу гепатозащитную активность проявил лютеолин, также содержащий  четыре ОН – группы в тех же положениях. Это говорит о том, что строение основного ядра (изофлавон и флавон) не оказывает существенного влияния на проявляемое ими гепатопротекторное действие.  Гликозилирование же 7-ОН группы лютеолина,  также как и метилирование фенильной гидроксильной  при С-3¹ группы c образованием цинарозида и хризоэриола соответственно способствовало уменьшению их гепатозащитного действия. Гликозилирование 7-ОН группы хризоэриола с образованием термопсозида сопровождается резким ослаблением его позитивного влияния на метаболически функциональное состояние печени в условиях гелиотриновой интоксикации. Наличием метоксильной группы по всей видимости, обусловлена также низкая активность гиспидулина.

Наиболее выраженную гепатозащитную активность в ряду изученных флавоноидов проявили соединения, относящиеся к флавонолам. В их ряду отмечен и достаточно высокий процент веществ с выраженной антиоксидантной активностью, что в данной работе определялось по содержанию в печени МДА, а ранее выявлялось в опытах in vitro по ингибированию процессов железоиндуцированного аскорбатзависимого перекисного окисления липидов (ПОЛ) [20]. Причем, обращал на себя внимание тот факт, что взаимосвязь  структуры и антиоксидантной активности, описанной в работе [20], во многом коррелировала с выявляемой взаимосвязью структуры флавоноидов и их гепатозащитной активностью. Это лишний раз может свидетельствовать о том, что  в основе биологического действия флавоноидов при развитии многочисленных патологий, сопровождающихся активацией ПОЛ, в том числе и гепатитов, лежит их антиоксидантный эффект. Так гепатозащитная активность кверцетина, морина, имеющих в кольце В две ОН – группы в 3¹, 4¹ (орто) и 2¹, 4¹ (мета) положениях соответственно, и мирицетина, отличающегося от первого наличием дополнительной ОН – группы в положении 5¹, вполне сопоставима.  Однако нужно отметить, что несмотря на отсутствие ОН- группы в кольце В, галангин (3, 5, 7 – тригидроксифлавон) показал самую выраженную гепатозащитную активность. При его введении активность сывороточной АлАТ была всего на 27,5% выше, чем у интактных животных (на 65,3% ниже контрольного уровня). Отмечено под его влиянием значительное понижение содержания МДА в печени (на 60,1%) и укорочение продолжительности гексеналового сна на 43,6%. Содержание гликогена в печени было всего на 19,7% ниже, чем у интактных животных.

Метилирование 3¹- ОН- группы кверцетина с образованием изорамнетина не отразилось существенно на выраженности его влияния на метаболически- функциональное состояние печени (по сравнению с кверцетином) . Следовательно наличие и  взаимное расположение ОН-групп в кольце В не оказывает значительного эффекта  на проявление гепатозащитного действия исследуемых соединений. Влияние гидроксильной группы при С- 3 на гепатопротекторную активность флавоноидов четко видно при сравнении активности лютеолина и кверцетина. Последний отличается от лютеолина только наличием дополнительной 3-ОН-группы и это приводит к увеличению гепатопротекторной активности кверцетина, о чем можно судить  по менее выраженному нарастанию  активности АлАТ в сыворотке крови, содержания МДА в печени и продолжительности гексеналового сна (содержание гликогена, в обоих случаях существенно не различалось).

Гликозилирование  флавонолов, также как и флавонов, как правило, уменьшало их гепатозащитное действие, что видно на примере действия  мирицетин-3-глюкозида и рутина. Мирицетин-3-глюкозид, содержащий один сахарный остаток, проявил заметно меньший  гепатозащитный эффект, чем его агликон. Наличие двух сахарных остатков в молекуле рутина приводило к выраженному снижению его активности по сравнению с кверцетином. Сходная зависимость наблюдается и при рассмотрении эффект лимоцитрина, проявившего хорошую гепатозащитную активность. Однако, гликозилирование его 7-ОН группы (кольцо А) ацетилированной биозой с образованием хаплозида С приводило  к ухудшению гепатозащитных свойств  этого соединения. Хаплогенин -7-О-глюкозид, в молекуле которого наряду с четырьмя  ОН-группами имеется сахарный остаток также проявил невысокую активность. Наличие в положении 8 изорамнетина метоксильной группы (лимоцитрин) также приводит к уменьшению гепатопротекторной активности.  Интересно отметить, что и по многим другим активностям проявляемым флавоноидами, была отмечена такая же закономерность, т.е. полиметоксилирование и гликозилирование соединений этого класса приводит к снижению их биологических эффектов   [1, 21] . Полученные данные однозначно указывают на то, что для проявления значительной гепатозащитной активности в этом ряду флавоноидов необходимо наличие свободных ОН-групп в положениях 3,5,7 (кольцо А), а также в положении С- 3, тогда как ОН-группы в кольце В на активность практически не влияют.

При анализе гепатозащитной активности  флаванонов также было установлено, что некоторые из них представляют в этом отношении большой интерес. Так, леманин – 5-дезоксифлавон в значительной степени предотвращал (по всем исследуемым показателям) негативное воздействие гелиотрина на метаболически-функциональное состояние печени животных. Вексибинол, содержащий дополнительную 5-ОН группу, показал значительно более слабый эффект. Изобавахин, также являющийся 5-дезоксифлавоном и содержащий пренильную группу в кольце А, проявил (если ориентироваться на большинство показателей – АлАТ, содержание гликогена и МДА) более низкую гепатопротекторную активность, чем вексибинол. Наличие же в его молекуле (кольцо В) второй пренильной группы – глаброл, приводит по большинству показателей (в данном случае – активность АлАТ, содержания гликогена, продолжительность гексеналового сна) к усилению эффекта.

Выявленной зависимости не отмечено в ряду 5,7– дигидроксифлавонов: соединения с пренильными группами (глабранин, изоглабранин и, как уже отмечалось, изобавахин) в целом проявляли низкую гепатозащитную активность. Эти данные указывают на то, что в проявлении способности предотвращать токсическое действие гелиотрина на печень 5-дезоксифлавонами, которые являются менее устойчивыми соединениями по сравнению с 5-оксифлавонами [22], определенную роль играет количество и место расположения пренильных групп. В проведенных экспериментах также было установлено, что суммарный препарат флавоноидов, выделенный из Pseudosophora alopecuroides и содержащий глаброл, вексибинол, изобавахин, вексибидин, лютеолин, халкон – аммотамнидин и др. [23] за счет эффекта потенцирования может еще более выражено предотвращать развитие негативных симптомов, отражающих поражение печеночной ткани. При введении данного суммарного флавоноидного препарата активность АлАТ у мышей после введения гелиотрина возрастало лишь на 18,7%, гликоген печени был ниже нормы на 18,4%, а увеличение содержания МДА в печени составляло только 20,3%. Продолжительность гексеналового сна у этих мышей также возрастала весьма незначительно (на 21,8%). И хотя значения определяемых показателей также носили по отношению к показателям интактных животных достоверный характер, тем не менее они были минимальными и в подавляющем большинстве случаев превосходили эффект индивидуальных соединений флавоноидного ряда.

Таким образом, в проведенных экспериментах выявлена закономерность гепатозащитной активности флавоноидов в условиях гелиотриновой интоксикации организма от содержания в них углеводных компонентов, метоксильных, пренильных групп и наличия, количества и месторасположения ОН-групп. Полученные данные указывают на целесообразность и перспективность выявления в ряду флавоноидов новых гепатозащитных средств для использования в практической медицине.

Список литературы:

1. Корулькин Д.Ю., Абилов Ж.А., Музычкина Р.А., Толстиков Г.А. Природные флавоноиды. – Новосибирск: Академическое изд-во «Гео» , 2007. -232 с.
2. Каримов А.М., Ботиров Э.Х., Маматханов А.У., Сагдуллаев Ш.Ш. Флавоноиды растений рода Scutellaria – Ташкент: «Fан van texnologia», 2016, 180 с.
3. 3. Литвиненко В.И. Флавоноиды и лекарственные препараты на их основе // Фармация Казахстана. – Спец. вып. – 2004. С. 16 – 19.
4.  Сыров В.Н., Батырбеков А.А., Киличова Г.Х. Иммуномодулирующие свойства флавоноидов из флоры среднеазиатского региона. – Ташкент: УП «Bulding print», 2011. - 91 c.
5. Абдуллаев Н.Х.  Патохимия и патогенетическая терапия хронических гепатитов и цирроза печени. – Ташкент: Медицина, 1968. -239 с.
6. Юлдашев М.П., Батиров Э.Х., Маликов В.М. Флавоноиды Thermopsis dolichocarpa // Химия природ. соедин. -1990. - №4. – С. 547 -548.
7. Юлдашев М.П., Батиров Э.Х., Вдовин А. Д. и др. Флавоноиды Thermopsis alterniflora // Химия природ. cоедин. -1989. - №3. – С. 352 - 359.
8. Юсупова С.С., Батиров Э.Х., Киямитдинова Ф., Маликов В.М.  Изофлавоноиды Cicer mogoltavicum // Химия природ. соедин. -1986. - №5. – С. 639 – 640.
9. Батиров Э.Х., Юлдашев М.П., Нежинская Г.А., Маликов В.М. Флавоноиды Ferula schair и F. samarkandica // Химия природ. соедин. -1979. - №5. – С. 727 - 728.
10. Шамьянов И.Д., Батиров Э.Х., Юлдашев М.П., Маллабаев А.,  Компоненты Saussurea elegans // Химия природ. соедин. -1983. - №6. – С. 796 - 797.
11. Икрамов М.Т., Мавашева Ф.А., Батиров Э.Х., Маликов В.М. Флавоноиды Lagonychium farctum // Химия природ. соедин. -1990. - №2. – С. 274 - 276.
12. Батиров Э.Х., Юлдашев М.П., Хушбактова З.А. и др.  Флавоноиды  Haplohyllum perforatum. Строение и гипоазотемическая активность хаплозида С. // Химия природ. соедин. -1987. - №1. – С. 66 - 70.
13. Батиров Э.Х., Киямитдинова Ф., Маликов В.М. Флавоноиды надземной части Glycyrrhiza glabra  // Химия природ. соедин. -1986. - №1. – С. 111 – 112.
14. Батиров Э.Х., Маликов В.М., Мирзаматов Р.Т. Хаплогенин -7 – О – гликозид из    Haplophillum perforatum. // Химия природ. соедин. -1980. - №6. – С. 836.
15. Iinuma M., Mizuno M. Natural occurrence and synthesis of  2¹-oxygenated Flavones, Flavonols,  Flavanones and Chalcones // Phytochemistry. - 1989. – Vol. 28, № 3. – P. 681 – 694.
16. Юсупова С.С., Батиров Э.Х., Абдуллаев Ш.В., Маликов В.М. Флавоноиды Vexibia alopecuroides // Химия природ. соедин. -1984. - №2. – С. 250 – 251.
17. Батиров  Э.Х., Юсупова С.С., Cаттикулов А. И др. Флавоноиды Ammothamnus  Lehmannii // Химия природ. соедин. -1987. - №4. – С. 516 – 524.
18. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике.- М.-: МЕД пресс информ, 2009. – 896 с.
19. Зуфаров К.А. Арипов У.А., Наджимутдинов К.Н., Князева Л.С. Влияние некоторых химических факторов внешней среды на действие лекарственных веществ,   метаболизирующихся в печени. – Ташкент: Медицина, 1979. – 151 с.
20. Хушбактова З.А., Юсупова С.М., Замараева М.В. и др. Взаимосвязь структуры и антиоксидантной активности некоторых флавоноидов из растений Центральной Азии //  Химия природ. соедин. -1996. - №3. – С. 350 – 356.
21. Рогинский В.А. Фенольные антиоксиданты.-  М.: Наука, 1988. – 247 с.
22. Dhar D.N. The chemistry of chalcones and related compounds. Wiley Intersci. Publ. -  New York, 1981. - 96 p.
23. Котенко Л.Д., Эргашева Ш.А., Халилов Р.М., Максумова Д.К., Маматханов А.У. Стандартизация корней с корневищами псевдософоры лисохвостной (Pseudosophora alopecuroides)// Фармацевтический журнал. – Ташкент, 2017.-№3.- С. 66-70.