ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ПОЛИСАХАРИДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ КУЛЬТИВИРОВАННЫХ МИЦЕЛИЕВ СПОРЫНЬЕВОГО ГРИБА CORDYCEPS MILITARIS

АННОТАЦИЯ

В статье описана иммуностимулирующая активность полисахаридов, полученных из культивированных мицелиев гриба Cordyceps militaris. Полисахариды значительно увеличивают количество лейкоцитов, лимфоцитов, антител в плазме крови, активность NK-клеток, степень фагоцитоза в перитонеальных макрофагах у иммунодефицитных животных.

Ключевые слова: Спорыньёвый гриб, Cordyceps militaris, Полисахариды, Иммуностимулирующая активность.

Введение

Грибы содержат много белков, полисахаридов, аминокислот, витаминов и микроэлементов, которые используются в качестве питательной пищи и специй для придания вкуса, а также для профилактики различных заболеваний, таких как рак и атеросклероз.

В частности, грибы рода Cordyceps используются как ценный лекарственный материал для увеличения продолжительности жизни и физической силы, он привлекает внимание к разработке противоопухолевых препаратов в ходе клинических исследований, поскольку обладает высокой иммуностимулирующей активностью, которая подавляет действие раковых клеток.

Cordyceps sinensis и Cordyceps militaris чаще всего используются в качестве лекарственных средств, но они истощены из природных источников, и методы искусственного выращивания еще не полностью разработаны.

Поэтому исследования технологии жидкого культивирования грибов, изученные в последнее время, проводятся для увеличения выработки мицелия в качестве заменителя плодового тела.

В частности, полисахариды гриба обладают высокой фармакологической активностью, такой как иммуностимулирующее и ингибирующее действие на опухолевые клетки, и востребованы при разработке новых лекарственных препаратов и клинических исследованиях.

Целью научной работы является изучение иммуностимулирующей активности полисахаридов из Cordyceps militaris рода Cordyceps.

Материал и Методы

Материалом исследования был полисахариды, полученных из культивированных мицелиев гриба C. militaris (L) Link.

Подсчет количества лейкоцитов и лимфоцитов периферической крови измеряли следующим образом: в камере Горяева подсчитывали количество лейкоцитов, количество лимфоцитов выражали в абсолютных числах после анализа мазка крови (окрашивание по Романовскому-Гимзе).

Реакцию прямой агглютинации измеряли следующим образом: у мышей, иммунизированных эритроцитами барана, кровь брали из глазных вен, плазму отделяли и иммобилизовали при 56 в течение 30 минут. В 96-луночном планшете проводили серию многократных разведений в плазме, добавляли тот же объем 2% суспензии эритроцитов овцы и инкубировали сначала при 37℃ в течение 2 часов, а затем при 4℃ в течение 24 часов и концентрации в плазме был определен.

Оценку активности фагоцитоза периферических макрофагов измеряли следующим образом: 1 мл 10% раствора пептона и 1 мл (2×10⁸) 2% суспензии эритроцитов овцы вводили в брюшную полость мыши с последующей повторной инъекцией после 56 ч. Через 30 минут после второй инъекции мышей декапитировали, собирали внутрибрюшинную жидкость и готовили мазок. Для оценки фагоцитарной активности и фагоцитарного индекса подсчитывали количество фагоцитарных макрофагов в 200 клетках. Степень фагоцитоза и индекс фагоцитоза были получены по следующим формулам:

Активность NK-клеток измеряли следующим образом: селезенку мыши гомогенизировали и центрифугировали в течение 10 минут при 1500 об/мин. Затем эритроциты гемолизировали путем добавления трис-аммонийхлорида в соотношении 1:4. Суспензию клеток, полученную путем промывки 3 раза с использованием центрифуги (10 минут при 2000 об/мин), доводили до концентрации 1×10⁷ клеток/мл. Затем клетки трижды промывали раствором Hens для получения сенсибилизированных вирусом клеток в концентрации 1×10⁶ клеток/мл. Клетки инкубировали в культуральном шкафу при 5% CO₂ (тип MC-10) в течение 4 часов, после чего 100 мкл суспензии переносили в 96-луночный планшет с плоским дном. Активность NK-клеток рассчитывали путем измерения поглощения света с использованием Microplate Reader A4 (MPRA4).

Результаты

Как показано в таблице 1, количество лейкоцитов периферической крови и лимфоцитов у мышей с иммунодефицитом значительно повышалось (p<0,01) при введении полисахарида в дозе 40 и 80 мг/кг.

Таблица 1.

Изменения числа периферических лейкоцитов и лимфоцитов у иммунодефицитных белых мышей

Также одним из показателей активности иммуной системы является концентрация антител к чужеродным антигенам в крови (таблица 2). Были проанализированна концентрация антител в плазме мышей к красным кровяным клеткам. Титры антител были значительно выше по сравнению с контрольной группой (p<0.01) при введении раствора полисахарида в дозе 40 и 80 мг/кг.

Таблица 2.

Изменения концентрации антител в сыворотке крови мышей

После проведения эксперимента по изучению активности NK-клеток были получены следующие результаты (таблица 3). Активность NK-клеток стромы селезенки экспериментальной группы, инъецированной полисахаридами в дозе 40 мг/кг, была значительно выше, чем у контрольной группы (p<0,01).

Таблица 3.

Влияние полисахаридов спорыньёвого гриба на активность NK-клеток стромы селезенки

Для изучения активности перитонеальных макрофагов у иммунодефицитных белых мышей была проведена серия инъекций полисахаридов в дозе 40 мг/кг в течение 10 дней. Как показано в таблице 4, активность фагоцитоза макрофагов экспериментальной группы, значительно повышалась (p<0,01) по сравнению с контрольной группой.

Таблица 4.

Влияние полисахаридов на активность фагоцитоза перитонеальных макрофагов у иммунодефицитных белых мышей

Обсуждение

Полисахариды значительно увеличивают количество лейкоцитов, лимфоцитов, антител в плазме крови, активность NK-клеток, степень фагоцитоза в перитонеальных макрофагах у иммунодефицитных животных.