НЕЙРОПРОТЕКТОРНЫЕ СВОЙСТВА ПЕПТИДА ARG-PRO-GLY-PRO

NEUROPROTECTIVE PROPERTIES OF THE PEPTIDE ARG-PRO-GLY-PRO

Elvira Zakirova

MA Department of genetics Bashkir State Pedagogical University named after M.Akmulla

Russia, Ufa

Liana Zainullina

PhD in Biological sciences, Institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Scientific Centre, Russian Academy of Sciences,

Russia;Ufa

Yulia Vakhitova

Dr. in Biological Sciences, Institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Scientific Centre, Russian Academy of Sciences,

Russia;Ufa

АННОТАЦИЯ

Показано, что пептид Arg-Pro-Gly-Pro не вызывает достоверного увеличения ДНК-связывающей активности HIF1α как в условиях нормальной оксигенации, так и в условиях фармакологически индуцированной гипоксии.

ABSTRACT

Revealed that the peptide Arg-Pro-Gly-Pro does not cause a significant increase in DNA-binding activity of HIF1α in conditions of normal oxygenation, and under conditions of pharmacologically induced hypoxia.

Ключевые слова: Arg-Pro-Gly-Pro; нейропротекция; гипоксия; фактор, индуцированный гипоксией (HIF1α).

Keywords: Arg-Pro-Gly-Pro; neuroprotection; hypoxia; factor induced by hypoxia (HIF1α).

Поиск и исследование новых лекарственных препаратов, способных повышать устойчивость ткани головного мозга к состояниям гипоксии и ишемии за счет активации собственных механизмов адаптации, на сегодняшний день является актуальной задачей фармакологии [7, с. 334].

Сегодня в свете проблемы повышения резистентности организма к гипоксии большое внимание уделяют специфическому белку – транскрипционному фактору (ТФ) – фактору, индуцированному гипоксией (HIF1α), активность которого увеличивается при снижении концентрации кислорода в крови и тканях. Показано, что этот фактор играет главную роль в системном ответе организма на гипоксию, синтезируется во многих тканях организма, в том числе в нервной ткани, где его экспрессия максимальна в нейронах [5 ,с. 8]. Таким образом, HIF1α  представляется удобной мишенью для фармакологического воздействия при нейропротекторной терапии.

Среди препаратов, воздействующих на различные патологии ЦНС, перспективными являются регуляторные соединения пептидной природы, однако их применение на практике затруднено из-за высокой нестабильности в организме и кратковременности оказываемых эффектов [6, с. 52]. Проблема может быть решена с помощью включения в молекулу аминокислотных последовательностей, устойчивых к действию пептидаз, например глипролинов. К настоящему моменту, к семейству глипролинов относят Pro-Gly (PG), Gly-Pro (GP), Pro-Gly-Pro (PGP), Gly-Pro-Gly-Gly (GPGG) и клинически применяемые Семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) и Селанк (H-Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro-OH) [2, с.38]. Глипролиновые пептиды обладают широким спектром биологической активности. Уже установлена высокая терапевтическая активность Селанка при ишемии мозга и в комплексной терапии при черепно-мозговых травмах [4, с. 7].

Наличие  нейромодулирующей активности Селанка стало основанием для его использования в качестве субстанции для создания нового пептидного аналога – Arg-Pro-Gly-Pro. Согласно литературным данным, этот пептид обладает антитромботической, антиагрегационной [3, с. 302] и противовирусной [1, с.175]. Но влияние на ЦНС этого тетрапетида еще не изучено.

В связи с этим, целью настоящего исследования являлось выявление возможной нейропротекторной активности Аrg-Pro-Gly-Pro, опосредованной через HIF-зависимый сигналинг.

Материалы и методы. Материалом для экспериментов послужили клетки линии SHSY-5Y (Российская коллекция клеточных культур, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Клетки культивировали при 37°С в 5 % CO₂ в среде DMEM (“Биолот”, Россия), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (“Sigma”, США), 2 мM L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина (“ПанЭко”, Россия).

Для проведения транзиентных трансфекций клетки линии SHSY-5Y рассаживали в количестве 100×10³ клеток на лунку в 96-луночных планшетах в 100 мкл среды без антибиотика (ДMEM, 10% FBS, 2 mML-Glu). Для изучения влияния соединений на ДНК-связывающую активность HIF1α использовали люциферазную репортерную конструкцию, содержащую последовательности связывания для ТФ HIF1α. Репортерная векторная конструкция получена на базе плазмидного вектора pTL-Luc (“Panomics”, США; несет ген люциферазы Photinus pyralis). Данной рекомбинантной конструкцией транзиентно трансфецировали клетки линии SHSY-5Y с помощью реагента Липофектамин 2000 (“Invitrogen”, США) согласно протоколу изготовителя.

Для нормализации полученных результатов клетки ко-трансфецировали плазмидой pRL-TK (“Promega”, США), кодирующей ген люциферазы Renilla reniformis.

Эксперименты проводили в 3 биологических повторностях. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли в рамках стандартного пакета методов статистического анализа Statistiсa 6.0 для Windows (StatSoft, США), GraphPad Prism 5.0. (GraphPad Software, США), применяя непараметрический t-критерий Вилкоксона.

Результаты и обсуждения. В результате настоящего исследования было показано, что исследуемый тетрапептид не вызывает концентрационно-зависимого изменения ДНК-связывающей активности транскрипционного фактора HIF1α в условиях нормоксии (рис.1 А).

Рисунок 1. Влияние Arg-Pro-Gly-Pro на ДНК-связывающую активность транскрипционного фактора HIF1α. В качестве контроля приняты базальные значения активности HIF1α в нестимулированных клетках, DFO - значения активности HIF1α в DFO-стимулированных клетках. Базальную и DFO‑индуцированную (100 мкМ, 6 ч) активность HIF1α детектировали после 24 ч инкубации с Arg-Pro-Gly-Pro (1, 10, 100 мкМ). Данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартная ошибка среднего (n = 3, * - p < 0.05 по отношению к контролю, ^# - p < 0.05 по отношению к группе DFO).

При моделированни гипоксии с помощью фармакологического миметика – дефероксамина (DFO) нами обнаружено статистически значимое увеличение ДНК-связывающей активности HIF1α на 70% (рис.1 Б). При инкубировании клеток с тетрапептидом на фоне модельной гипоксии нами обнаружено постепенное снижение активности изучаемого ТФ. Так, 10мкМ тетрапептида достоверно приводят к снижению ДНК-связывающей активности HIF1α на 17% по сравнению с группой DFO. Однако, при увеличении концентрации Аrg-Pro-Gly-Pro до 100мкМ происходит стабилизация активности HIF1α, которая сохраняется на уровне соответствующего контроля.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об отсутствии у изучаемого пептида выраженного, дозо-зависимого влияния механизмы HIF1α-опосредованной транскрипционной активности. Между тем нейропротекторная активность данного тетрапептида, на наш взгляд, может быть опосредована другими механизмами и/или в других модельных системах.

Список литературы:

1. Андреева Л.А., Мезенцева М. В., Наровлянский А. Н., Нагаев И. Ю., Шаповал И. М., Щербенко В. Э., Руссу Л. И., Мясоедов Н. Ф., Перспективы создания новых пептидных лекарственных препаратов, обладающих противоинфекционной и иммуномодулирующей активностью // Инфекция и иммунитет. 2011. №2. С. 171-176.
2. Ашмарин И.П., Каменский А.А., Ляпина Л.А., Мясоедов Н.Ф., Самонина Г.Е. Глипролины как самостоятельные регуляторы и стабилизаторы других пептидов // Вопр. биол., мед. и фармацевт. химии. 2002. № 1. C. 24–27
3. Григорьева М.Е., Оберган Т.Ю. Антитромботическое действие глипролина Arg-Pro-Gly-Pro в условиях иммобилизационного стресса на фоне экспериментального метаболического синдрома // Соврем. технол. мед.. 2016. №4. С. 300-302.
4. Новиков В. Е., Кулагин К. Н. Средства фармакологической коррекции при черепно-мозговой травме // Обзоры по клинич. фармакол. и лек. терапии. 2003. №1. С. 2-13.
5. Новиков В. Е., Левченкова О. С.Гипоксией индуцированный фактор (HIF-1α)  как мишень фармакологического действия // Обзоры по клинич. фармакол. и лек. терапии. 2013. №2. С. 8-16.
6. Скребицкий В.Г., Кася А.П., Поваров И.С., Кондратенко Р.В., Сломинский П.А. Нейропептидный препарат Селанк: биологическая активность и фундаментальные механизмы действия // Нервные болезни. 2016. №4. С. 52-56
7. Dirnagl U., Meisel A. Endogenous neuroprotection: mitochondria as gateways to cerebral preconditioning? Neuropharmacology 2008; 55: 334–344.