ЛЕЧЕБНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ АЛГОРИТМ ПОДГОТОВКИ ЭНДОМЕТРИЯ ДЛЯ ИМПЛАНТАЦИИ ЭМБРИОНОВ В ПРОГРАММАХ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ У ЖЕНЩИН С ТРУБНО-ПЕРИТОНЕАЛЬНЫМ ФАКТОРОМ БЕСПЛОДИЯ

DIAGNOSTIC-TREATMENT ALGORITHM FOR THE PREPARATION OF THE ENDOMETRIUM FOR IMPLANTATION OF EMBRYOS IN PROGRAMS OF ASSISTED REPRODUCTIVE TECHNOLOGIES IN WOMEN WITH TUBAL PERITONEAL FACTOR OF INFERTILITY

Iryna Kotsiubska

scientific applicant Vinnitsa National Medical University,

Ukraine, Vinnitsa

Olga Bulavenko

a head of the obstetretic -gynecology department № 2, Doctor of the medical sciences, professor, Vinnitsa National Medical University,

Ukraine, Vinnitsa

АННОТАЦИЯ

В ходе нашего исследования доказано, что дефицит продукции α2-микроглобулина фертильности железистым эпителием эндометрия может быть одним с патогенетических механизмов имплантационных неудач в программах ВРТ, исходя из этого, нами также была предложена более ранняя поддержка лютеиновой фазы пациенткам с трубно-перитонеальным фактором бесплодия в программах экстракорпорального оплодотворения.

ABSTRACT

In the course of our study, it was proved that the deficit of production of α2-microglobulin fertility by the glandular epithelium of the endometrium can be one of the pathogenetic mechanisms of  implant failures in ART programs, suggesting that we also offered earlier support for the luteal phase to patients with tubal peritoneal infertility factor in programs In vitro fertilization.

Ключевые слова: трубно-перитонеальный фактор бесплодия; гликоделин; эндометрий; поддержка лютеиновой фазы; вспомогательные репродуктивные технологии; экстракорпоральное оплодотворение; прогестерон; триггер овуляции; пункция фолликулов.

Keywords: Tubal-peritoneal factor of infertility; Glycodelins; Endometrium; Support of the luteal phase; Assisted reproductive technologies; In vitro fertilization; progesterone; Ovulation trigger; Puncture of follicles.

Цель – улучшить эффективность лечения женского бесплодия трубно-перитонеального генеза методом экстракорпорального оплодотворения путем оптимизации лечебно-диагностических процессов на дотрансферном этапе путем усовершенствования методик подготовки эндометрия для имплантации эмбрионов.

Методы исследования. Исследование было проведено в период с 2012 г. по 2016 г. на кафедре акушерства и гинекологии № 2 Винницкого национального медицинского университета им. Н.И. Пирогова (зав. кафедрой д-р мед. наук, проф. О.В. Булавенко). Набор пациентов осуществлялся в медицинском центре «Медивин» г. Винница, Украина и  центре репродуктивной медицины «РемедиВин» г. Винница, Украина. Проведено проспективное обследование 80 женщин, которые были сгруппированы в основную (пациентки с трубно-перитонеальным фактором бесплодия) (n=60) и контрольную группы (практически здоровые женщины) (n=40). Формирование групп наблюдения осуществлялось методами сплошного и выборочного анализа.

Критерии зачисления пациентов в основную группу исследования:

• Пациентки с трубно-перитонеальной формой бесплодия;

• Проведена предварительная лапароскопическая окклюзия фаллопиевых труб, которые перенесли оперативное вмешательство;

• Неудачные анамнестические ЭКО, которые были связаны с особенностями лечения;

• Возраст пациенток до 35 лет;

• Желание и возможность принимать участие в данном исследовании;

• Этническая однородность.

Критерии зачисления пациенток в контрольную группу исследования:

• Практически здоровые пациентки, включенные в программу ЭКО по мужскому фактору бесплодия (по данным спермограммы их супругов);

• Возраст пациенток до 35 лет;

• Желание и возможность принимать участие в данном исследовании;

• Этническая однородность.

Критерии исключения пациенток:

• Любые клинически значащие состояния, которые, по мнению исследователя, могли повлиять на безопасность пациентки, результаты оценок, проведенных в рамках исследования, или нарушить процесс проведения исследования;

• Имеющиеся в данный период заболевания или состояния, которые могли повлиять на интерпретацию данных о безопасности и эффективности терапии или являются противопоказаниями для нее;

• Наличие других факторов женского бесплодия;

• Наличие миомы, деформирующей полость матки;

• Острые воспалительные заболевания репродуктивной сферы;

• Наличие некомпенсированной соматической патологии;

• Отсутствие яйцеклеток после проведенной пункции фолликулов;

• Отсутствие возможности переноса 1-2-х эмбрионов;

• Низкое качество переносимых эмбрионов.

Определение концентрации прогестерона в сыворотке крови проводилось с помощью наборов тест-системы фирмы «Hoffmann-La Roche, Ltd.» (Швейцария). В качестве референтных значений использовались показатели содержания гормонов в сыворотке крови у здоровых женщин детородного возраста с регулярным ритмом менструаций.

Для исследования содержания гликоделина в менструальной крови применялся иммуноферментный анализ на тест-системах с использованием диагностических наборов моноклональных антител к гликоделину, а также диагностических наборов «ГЛИКОДЕЛИН (РР14)-ELISA» (производитель ЗАТ «БиоХимМак», Россия). Для исследования материал (менструальную кровь, полученную на 2–3 сутки менструации) заливали в среду для заморозки Tissue-Tek (Miles Inc., USA).

Иммуноферментный анализ (ELISA) использовался на стриповом иммуноферментном анализаторе «Нumareader single» (Германия) при длине волны 450 нм и дифференцированным фильтром 630 нм. Расчеты проводились на основании данных, полученных измерением калибровочных растворов, в соответствии к построенной калибровочной кривой. На основании построенной кривой вычислялись значения полученных данных.

На третьем этапе нашего проспективного исследования была проведена апробация разработанного алгоритма медикаментозной коррекции лютеиновой фазы в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и оценка клинической эффективности данного введения.

Женщины основной группы были разделены в зависимости от приема интравагинальной формы прогестерона (в нашей работе мы использовали препарат «Лютеина»):

I подгруппа – 30 пациенток получали прогестероновый препарат со дня введения триггера овуляции в дозе по 200 мг 2 раза в день интравагинально до теста на беременность и в случае наступления беременности – до 8–9 недель беременности.

II подгруппа – 30 пациенток получали прогестероновый препарат со дня пункции фолликулов в той же дозе по 200 мг 2 раза в день интравагинально до теста на беременность и в случае наступления беременности – до 8–9 недель беременности.

Кроме гинекологических и обще-клинических исследований, а также определения гликоделина в менструальной крови на 2-3-е сутки менструального цикла, всем женщинам в программе ЭКО на 2-5-й день менструального цикла проводили исследование в сыворотке крови концентраций фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), лютеинизирующего гормона (ЛГ), эстрадиола (Е2), пролактина (ПРЛ) и антимюллерова гормона. Состояние фолликулярного аппарата и эндометрия определяли с помощью ультразвукового исследования с доплерометрией маточных сосудов на ультразвуковом аппарате HDI 4000 (№4703-0037-01 Rev С 2002 (Philips Ultrasound P.O. Box 3003 Bothell WA98041-3003 USA)). Также на этапе проспективного исследования по определенным показаниям проводилась гистероскопия с помощью жесткого эндоскопа с наружным диаметром дистальной части 2,4 мм фирмы KARL STORZ.

Стимуляция суперовуляции у всех пациенток исследуемых групп проводилась гонадотропными препаратами с антагонистами гонадотропин-рилизинг гормонов. Дозы и вид стимуляционных гонадотропных препаратов подбирались индивидуально, но в среднем составляли 225 ЕД ± 25 ЕД в сутки. Цикл стимуляции в среднем продолжался 9 дней (8-10 дней). В качестве триггера овуляции всем пациенткам назначался хорионический гонадотропин («Хорагон») в дозе 10 000 ЕД.

Трансвагинальную пункцию проводили через 35-36 часов после введения «овуляторной дозы» хорионического гонадотропина, под ультразвуковым контролем вагинальным доступом.

Всем пациенткам перенос эмбрионов осуществлялся на 3-5-е сутки. Качество эмбрионов определялось процентом оплодотворения и дробления, соответствие времени дробления и культивирования, степени фрагментации эмбрионов.

Статистическую обработку данных проводили методами описательной статистики и одновременно однофакторного анализа (критерий Стьюдента) с использованием статистического пакета AnalystSoft Inc., BioStat – Версия 2009. Критическая величина уровня значимости для оценки статистической значимости принята равной 0,05.

Актуальность.

Демографические показатели во всем мире на протяжении последних десятилетий носят неблагоприятный характер. Рождаемость не имеет тенденции к увеличению, определяя с увеличением показателя смертности негативный прирост населения.

Бесплодие в браке в данное время остается наиболее актуальной проблемой в акушерско-гинекологической практике, несмотря на большое количество проведенных исследований, которые посвящены разным причинным факторам и аспектам [2; 8]. За последнее десятилетие частота бесплодных браков увеличилась с 11 до 19 % и имеет тенденцию к последующему увеличению [3]. Исходя из этого, лечение бесплодия стоит рассматривать как резерв для рождения желанных детей и увеличения в будущем потенциала разных стран. Именно потому важным и принципиальным этапом в лечении бесплодия разного генеза стали разработка и внедрение в современную акушерско-гинекологическую практику методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Данные методы лечения дают возможность многим бездетным парам, женщинам реализовать функцию рождения детей при всех формах бесплодия, в том числе и тех, которые считались безнадежными еще несколько десятилетий назад [5]. Имплантация эмбриона в эндометрий является довольно сложной процедурой. Большое число гистологических, биохимических и физиологических изменений подготавливают эндометрий для оптимальной адгезии эмбриона, дальнейшей его инвазии и развития на ранних стадиях гестации. Процесс имплантации возможен только при условии соответственной чувствительности эндометрия и его способности к полноценной имплантации эмбриона для дальнейшего его развития. Еще до оплодотворения прогестерон вызывает в нем децидуальное преобразование и готовит его к имплантации, способствует дополнительному разветвлению эндометриальных желез и последующей гипертрофии эпителиоцитов, которые синтезируют эндометриальные белки, к которым относится α2-микроглобулин фертильности, или гликоделин. У небеременных женщин синтез гликоделина осуществляется железистыми эпителиальными клетками эндометрия и мигающим эпителием маточных труб [6]. Гликоделин является мощным иммуносупрессором. Доказано, что при нормальной функции яичников уровень гликоделина очень низкий в преовуляторном периоде, увеличение его концентрации начинается во время последней недели лютеиновой фазы, достигая своего пика [4]. При этом высокий уровень гликоделина сохраняется во время первых дней следующего менструального цикла. Особенно интересно отметить, что начало синтеза и секреции гликоделина совпадает со временем попадания бластоцисты в полость матки, где этот белок обеспечивает локальное угнетение влияния материнской иммунной системы на эмбрион, который развивается [7]. Гликоделин также ограничивает миграцию клеток эндометрия, но в то же время стимулирует более полноценную инвазию трофобласта.

Поиск эффективных и патогенетически обоснованных программ восстановления репродуктивного здоровья, особенно детородной функции у женщин с трубно-перитонеальной формой бесплодия, может стать одним из резервов снижения материнской заболеваемости и благоприятного вынашивания беременности в дальнейшем.

Результаты (Findings)

Всем женщинам, которые принимали участие в проспективном исследовании, было проведено исследование на определение α2-микроглобулина фертильности в менструальной крови и прогестерона в сыворотке крови (табл. 1).

Таблица 1.

Результаты исследования гликоделина в менструальной крови и прогестерона в сыворотке крови (проспективное исследование), n=100, М+m

Примечание: *разница достоверная относительно группы сравнения (р<0,05).

Средний уровень гликоделина у пациенток с анемнестической трубно-перитонеальной формой бесплодия был достоверно ниже, чем у женщин группы сравнения (при двухфазном менструальном цикле), и составлял 4 026,5 ± 624,2 нг/мл, против 32 862,4 ± 236,2 нг/мл, соответственно (р<0,05).

Определение уровня прогестерона во вторую фазу менструального цикла (19-24 день) показало, что показатели прогестерона в сыворотке крови у женщин с трубно-перитонеальным фактором бесплодия были низкие и составили в среднем 10,2 ± 2,8 нмоль/л, причем у женщин из группы контроля аналогичный показатель составил 25,1 ± 2,9 нмоль/л (р<0,05).

Физиологический менструальный цикл имел место у 11 пациенток из основной клинической группы (18,3 %). Отсутствие овуляции (показатель гликоделина меньше 2 000 нг/мл) был диагностирован у 20 пациенток (33,3 %) с трубно-перитонеальным фактором бесплодия. Почти у каждой второй пациентки с бесплодием (48,3 %), несмотря на овуляцию, лютеиновая фаза менструального цикла была неполноценной (показатель гликоделина 2 000-10 000 нг/мл).

В основной группе клинического исследования нами был проанализирован один из показателей результативности ЭКО, в частности частота наступления беременности в стимулированных циклах.

При анализе вышеизложенного показателя было установлено, что беременность (биохимическая и клиническая) была диагностирована у 29 пациенток (48,3 %). Стоит отметить, что, соответственно терминологии ВРТ, под биохимической беременностью следует понимать случаи наступления беременности, которые подтверждаются только результатами определения хорионического гонадотропина человека в сыворотке крови или моче, которая не развивается в дальнейшем в клиническую беременность. В свою очередь, клинической считается беременность, факт которой установлен с помощью ультразвуковой визуализации одного или нескольких плодных яиц.

Хотелось бы отметить, что беременность была диагностирована у 17 пациенток с трубно-перитонеальной формой бесплодия, которые начали прием интравагинальной формы прогестерона со дня введения триггера овуляции (56,7 %). У пациенток, которые начали использовать тот же самый прогестероновый препарат в одинаковой дозе, но со дня пункции фолликулов, показатель, который анализировался, имел место в 12 случаях (40 %) (ВР 0,72, 95 % ДИ [0,44 – 1,19], Р=0,21) (табл. 2).

Таблица 2.

Оценка наступившей клинической эффективности гормональной поддержки у пациенток с трубно-перитонеальной формой бесплодия (n=60).

Примечание: * установленная достоверность отличий (р<0,05).

По данным таблицы 2 видно, что общая частота наступления биохимической беременности среди всех пациенток составила 10,0 %, из них в первой подгруппе в 2 случаях, а во второй – 4 (ВР 0,35, 95 % ДИ [0,08 – 1,63], Р=0,18).

Обращает на себя внимание тот факт, что среди пациенток, которые получали интравагинально прогестероновый препарат («Лютеина») со дня введения триггера овуляции, частота имплантаций была выше – 15 (50 %), чем во второй подгруппе сравнения (начало назначения прогестеронового препарата в день пункции фолликулов) – 26,7 % (ВР 0,68, 95 % ДИ [0,45 – 1,03], Р=0,07).

Количество полученных беременностей была существенно ниже во второй подгруппе исследования, чем у пациенток, которые начали прием прогестеронового препарата со дня введения триггера овуляции (I подгруппа), 20,0 % против 46,7 % (ВР 0,67, 95 % ДИ [0,46 – 0,97], Р=0,04).

Интересно отметить, что у пациенток с трубно-перитонеальным фактором бесплодия, которые получали прогестероновый препарат в день триггера овуляции, наблюдалась тенденция увеличения частоты наступления многоплодной беременности, а именно двойней – 8 случаев (26,7 %) из статистически значащей разницей между группой, в которой пациентки получали вышеуказанный препарат в день пункции фолликулов – 2 (6,7 %) (ВР 0,76, 95 % ДИ [0,62 – 0,99], Р=0,04).

Статистически существенное преобладание случаев многоплодной беременности может опосредованно подтвердить, что период назначения прогестерона в день введения триггера овуляции является оптимальным для исследуемой нами категории пациентов в программах ЭКО.

Согласно поставленной нами цели исследования, у пациенток с наступившими в ходе ЭКО беременностями был проведен сравнительный анализ структуры и частоты осложнений I триместра гестации, как наиболее уязвимого периода для индуцированной беременности в зависимости от начала приема экзогенного прогестерона (табл. 3).

Таблица 3.

Анализ частоты гестационных осложнений в I триместре у пациенток с трубно-перитонеальным фактором бесплодия, в зависимости от периода назначения прогестерона, n=20

Примечание: * установленная достоверность отличий (р<0,05).

Учитывая данные, приведенные в таблице 3, у пациенток обоих исследованных подгрупп отмечались специфические осложнения наступивших беременностей в результате программ ВРТ. Так, в первой и во второй подгруппах было зафиксировано по 1 случаю позднего синдрома гиперстимуляции яичников средней степени тяжести в сроке 6-7 и 9-10 недель беременности соответственно, причем в обоих случаях на фоне успешной имплантации эмбрионов.

Наиболее распространенным осложнением беременности I триместра беременности у пациенток с трубно-перитонеальным фактором бесплодия обеих подгрупп была угроза ее прерывания, что фиксировалось в 13 случаях (65,0 %) в общей популяции. Среди женщин, которые получали препараты экзогенного прогестерона в день триггера овуляции, подобное осложнение отмечалось в 8 случаях (57,1 %) и у пациенток, которые получали прогестерон в день пункции фолликулов – 5 (83,3 %), ВР 0,69, 95 % ДИ [0,39 – 1,22], Р=0,2. Следует отметить, что указанное осложнение беременности отмечалось во всех случаях при многоплодной беременности. По данным ультразвукового исследования отслойка хориона с формированием ретрохориальной гематомы отмечалась в 5 (35,7 %) и в 4 (66,7 %) случаях угрозы выкидыша в I и ІІ подгруппах сравнения соответственно (ВР 0,54, 95% ДИ [0,22 – 1,32], Р=0,17).

У женщин с трубно-перитонеальным фактором бесплодия, которые начали принимать прогестерон в день триггера овуляции, ранние репродуктивные потери отмечались в 3 (21,4 %) случаях: у 1 (7,1 %) была выявлена остановка развития эмбриона и его гибель (многоплодная беременность), у 2 (14,2 %) случился самопроизвольный выкидыш (многоплодная беременность). У пациенток второй подгруппы исследования прерывание беременности произошло в 4 (66,7 %) случаях: в 2-х (33,35 %) в результате самопроизвольного выкидыша (многоплодная беременность), еще в 2-х (33,35 %) случаях имела место беременность, которая не развивалась. Таким образом, показатель соотношения рисков по частоте ранних репродуктивных потерь составил 0,32 при 95 % ДИ [0,10 – 1,02], Р=0,053 и указывал на почти достоверное отличие между подгруппами сравнения нашего проспективного исследования. Чаще всего прерывание беременности происходило в сроке 8-12 недель.

Отдельно хотелось бы отметить тот факт, что у 10 пациенток (71,4%) с трубно-перитонеальным бесплодием, принимающих экзогенный прогестерон со дня триггера овуляции, клиническая беременность в рамках программы ЭКО закончилась родами живым плодом, при общем показателе по группе 33,3 %. У пациенток, которые получали тот же прогестероновый препарат в одинаковой дозе, но со дня пункции фолликулов, роды живым плодом имели место только в 2 случаях (33,35 %) при общем показателе по группе – 6,7 % (ВР 0,43, 95% ДИ [0,16 – 1,17], Р=0,098).

Выводы (Conclusions):

1. У пациенток с трубно-перитонеальным фактором бесплодия отмечается достоверное уменьшение показателей гликоделина в менструальной крови;
2. Продукция эндометриального гликоделина зависит от уровня эндогенного прогестерона;
3. Дефицит продукции гликоделина железистым эпителием эндометрия может бать одним из патогенетических механизмов неудач имплантации;
4. Комплексная диагностика состояния эндометрия на основании определения гликоделина в менструальной крови позволяет рекомендовать данное исследование для проведения эффективной прегравидарной подготовки для восстановления функции эндометрия и проводить профилактику развития гестационной патологии, особенно у пациенток в программах вспомогательных репродуктивных технологий;
5. Прием прогестероновых препаратов со дня введения триггера овуляции не имел существенных отличий по показателям частоты наступления беременности и имплантации по сравнению с назначением их в день пункции фолликулов. Существенные отличия отмечались по наступлению клинической беременности и многоплодной беременности у пациенток, которые начали поддержку лютеиновой фазы в программах ЭКО со дня введения триггера овуляции.
6. Более раннее начало приема прогестероновых препаратов у женщин с трубно-перитонеальным фактором бесплодия, а именно со дня введения триггера овуляции, способствует полноценной инвазии трофобласта и качественной имплантации, что определяет успешный результат беременности. Ранние репродуктивные потери были диагностированы реже (ВР 0,32, 95 % [0,10 – 1,02], Р=0,053); частота рождения живым плодом – в 71,4 % против 33,35 % случаев, у пациенток, получавших прогестероновые препараты со дня введения триггера овуляции.

Заключение (Conclusions)

Предложенное нами назначение поддержки лютеиновой фазы со дня введения триггера овуляции интравагинальным прогестероном («Лютеина») в дозе 400 мг/сутки позволяет увеличить частоту имплантации эмбрионов и  уменьшить частоту самопроизвольных выкидышей в программах экстракорпорального оплодотворения у пациенток с трубно-перитонеальной формой бесплодия.

Список литературы:

1. «Бедный» овариальный ответ в программах ЭКО / И.В. Тетерина, Р.Э. Ванян, Е.А. Калинина и др.// Акуш. и гинек. – 2013. – № 9. – С. 4–12.
2. Корнеева И.Е., Шуршалина А.В., Феоктистов А.А. Бесплодный брак: Современные подходы к диагностике и лечению. – М.: Медицина, 2005. – С. 616.
3. Ранние сроки беременности / Под ред. В.Е. Радзинского, А.А. Оразмурадова. – 2-е изд., испр. и доп. – М.: Status Praesens, 2009. – 480 c.
4. Alok A., Karande A. The role of glycodelin as an immune-modulating agent at the feto-maternal interface / A. Alok, A. Karande // Journal of Reproductive Immunology. – 2009. – Vol. 83(1-2). – P. 124–127.
5. Gearhart J., Coutifaris C. In vitro fertilization, the Nobel Prize, and human embryonic stem cells / J. Gearhart, C.Coutifaris // Cell Stem Cell. – 2011. – Elsevier Inc. 8. – P. 12-15.
6. Glycodelin is present in pinopodes of receptive-phase human endometrium and is associated with down-regulation of progesterone receptor B / Stavreus-Evers A., Mandelin E., Koistinen R., et al. // Fertility and Sterility. – 2006. – Vol. 85(6). – P. 1803–1811.
7. Glycodelin suppresses endometrial cell migration and invasion but stimulates spheroid attachment / K.H. So, C.L. Lee, W.S. Yeung et al. // Reprod Biomed Online. – 2012. – V. 24. – № 6. – Р. 639-645.
8. Török P., Major T. New methods for the ambulatory evaluation of female infertility / P.Török, T.Major //Orv Hetil. – 2013. – V. 154(33). – P. 1287-1290.