ПРОБЛЕМЫ ХРАНЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ

АННОТАЦИЯ

В работе представлены результаты исследования гель-пленки бактериальной целлюлозы после 1 месяца хранения в герметичном пакете. В течение этого срока пакет открывался 10 раз для обеспечения контакта  с окружающей средой. В результате на поверхности пленки сформировались пятна серого и розового цветов. Высушенный образец бактериальной целлюлоз в последствии исследовался методом сканирующей зондовой микроскопии.

ABSTRACT

The paper presents the results of a study of bacterial cellulose gel film after 1 month of storage in a sealed bag. During this period, the package was opened 10 times to ensure contact with the environment. As a result, spots of gray and pink colors were formed on the surface of the film. The dried bacterial cellulose sample was subsequently examined by scanning probe microscopy.

Ключевые слова: бактериальная целлюлоза, хранение, зондовая микроскопия.

Keywords: bacterial cellulose, storage, probe microscopy.

Бактериальная целлюлоза (БЦ) – органический материал, синтезируемый микроорганизмами внеклеточно. Этот биоматериал обладает высокой механической прочностью, химической стабильностью и кристалличностью. Так же, БЦ не содержит в себе примесей лигнина и гемицеллюлозы, то есть это более химически чистый материал, чем растительная целлюлоза [1]. БЦ используется во многих отраслях промышленности, например, в биомедицине в качестве биоматериалов для тканевой инженерии и лечения ран [2].

Этому материалу присущи уникальные физико-механические свойства, благодаря его фибриллярной сетчатой структуре. Нано метровая толщина фибрилл обеспечивает высокую плотность водородных связей, объединяющих фибриллы в прочную сетку с большой внутренней поверхностью [3]. Благодаря наличию развитой сети пор и капилляров различного диаметра БЦ обладает очень высокой водопоглотительной и водоудерживающей способностью. Для высушенных пленок БЦ характерно упруго-хрупкое поведение, причем модуль Юнга таких пленок может достигать 15–20 ГПа [4]. Напротив, БЦ, содержащая воду (в нативном состоянии или смоченная после высушивания), характеризуется весьма высокой степенью деформируемости в широком диапазоне условий испытаний разными методами [5]. Практическое применение БЦ часто требует контакта с водными растворами электролитов (в первую очередь солей, входящих в состав тканевых жидкостей и физиологических растворов).

Бактериальная целлюлоза, применяемая для заживления ран, находится в состоянии гель-пленки. Однако ее длительное хранение в таком виде приводит к развитию в ней патогенной микрофлоры. В связи с этим, задачей данной работы является изучение хранения бактериальной целлюлозы в виде гель-пленки, а также установление того, какие микроорганизмы могут развиваться БЦ при неправильном хранении.

Объектом исследования была неочищенная бактериальная целлюлоза, полученная в лаборатории ОмГАУ.

Исследования проводились полуконтактным методом сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ) на микроскопе NTEGRA ЗАО NT-MDT (Россия). В работе использовался зонд «HA_NC  Etalon» жесткостью 12 N/m.

Для обеспечения длительного хранения БЦ в исходном виде необходимо выяснить какие микроорганизмы могут возникать в ней, для того, чтобы в последствии подобрать инструменты воздействия на них. Для этого, в ходе работы были получены образцы неочищенной БЦ, которая хранилась в ограниченном пространстве с поддержанием высокой влажности. В процессе хранения в ней возникли 2 вида патогенных организма, наличие которых проявилось в виде пятен на поверхности образца черного и розового цветов. С целью выявления характера поражения материала, а также идентификации микроорганизмов, были проведены микроскопические исследования образцов высушенной БЦ в трех участках: чистый участок без различных видимых нарушений, изменений и повреждений, темный участок и участок ярко розового цвета.

Ниже на рис. 1 представлен типичный вид неповрежденной поверхности, размером 10х10 мкм.

Рисунок 1. Структура чистого участка БЦ: (а) - 2d – изображение, (б) – сигнал mag, (в) - 3d - изображение

На данных участках поверхности наблюдается структура с ярко выраженными плотно упакованными микрофибриллами. Эти микрофибриллы интенсивно переплетены между собой, образуя нитевидную лентоподобную структуру. Так же наблюдается менее выраженный макрорельеф поверхности. Средний диаметр микрофибрилл составляет 2,5 мкм. Средняя шероховатость (Sa) составила 249,5 nm. Порядковый максимум составляет 1,0000 µm, а срединное 0,7255 µm. Площадь поверхности равна 9591 µm².

Ниже на рис.2 показан вид участка БЦ, содержащего темное пятно, размер скана 10х10 мкм.

Рисунок 2. Структура черного участка БЦ: (а) - 2d – изображение, (б) – сигнал mag, (в) - 3d - изображение

Черный цвет на поверхности образца вызван присутствием, по-видимому, плесенного грибка. Это следует из присутствия новообразований, представляющих собой тонкие бесцветные нити. Плесень имеет мицелий, который представлен большой недифференцированной клеткой, которая обладает большим количеством ядер в цитоплазме. Перегородки в клетке образуются в период размножения. Это способствует отделению спорангиев – репродуктивных органов. Структура БЦ по сравнению с чистой, поменялась. Она стала более пористой. Появились гифы, головки со спорами и грибница (мицелий). На участке справа располагается грибница с вертикальными нитями, на концах которых расположены споры. Нити боле крупные, протягивающиеся вдоль всего участка. Их средний диаметр составляет 6,5 µm. Так же наблюдаются остатки бактерий – продуцентов. Ярко выраженный продуцент слева имеет размер 10 µm.

Средняя шероховатость (Sa) составила 227,0 nm. Порядковый максимум составляет 1,0000 µm, а срединное 0,7961 µm. Площадь поверхности равна 10244 µm².

На рис. 3. представлен вид поверхности БЦ, окрашенный микроорганизмом в розовый цвет.

Рисунок 3. Структура розового участка БЦ: (а) - 2d – изображение, (б) – сигнал mag, (в) - 3d - изображение

На данном участке образца присутствуют включения шарообразной формы.  На основании литературного обзора можно предположить, что данными включениями являются бактерии, продуценты.

Так же сохранилась лентоподобная структура. Средний диаметр включений составляет 12,5 µm, а микрофибрилл 3 µm. Наблюдается ярко выраженный рельеф поверхности. Розовый цвет образца является природой дефекта.

Средняя шероховатость (Sa) составила 203,7 nm. Порядковый максимум составляет 1,0000 µm, а срединное 0,7412 µm. Площадь поверхности равна 10209 µm².

При асептическом хранении гель пленки на поверхности и в объеме БЦ обнаружено колонии плесневых грибов темного цвета. Ветвящиеся гифы, врастаются в гель пленку, часть их находится на поверхности фибрилл, являясь репродуктивными. Таким образом, гель пленка БЦ может является субстратом для развития микроскопических грибов, предположительно класса Аскомицетов.

Список литературы:

1. Гладышева, Е.К. Обоснование выбора питательной среды для синтеза бактериальной целлюлозы / Е.К. Гладышева // Вестник алтайской науки. – 2014. – №1. – С. 307 – 310.
2. Физико-химическая механика бактериальной целлюлозы / З.Н. Скворцова, Т.И. Громовых, В.С. Грачев,  В.Ю. Траскин   // Коллоидный журнал. - 2019. - Т. 81, № 4.- С. 441-452.
3. Abeer, M.M., Amin, M.C.I.M., Martin, C.  A review of bacterial cellulose‐based drug delivery systems: their biochemistry, current approaches and future prospects / M.M. Abeer, M.C.I.M. Amin, C. Martin //   J. Pharm. Pharmacol. -  2014.- Vol. 66.- P. 1047–1061.
4. Characterization of Bacterial Cellulose by Gluconacetobacter hansenii CGMCC 3917 / X. Feng, N. Ullah, X. Wang [et al.]. - DOI: https://  10.1111/1750-3841.13010 // Food Sci.- 2015.- Vol. 80.- P. 2217.
5. Cellulose: Fascinating Biopolymer and Sustainable Raw Material / D. Klemm, B. Heublein, H.P. Fink, A. Bohn. - DOI: https:// 10.1002/anie.200460587 // Angewandte Chemie International Edition/ - 2005. -  Vol. 44 (22). – P. 3358-3393.
6. Production and characterization of bacterial cellulose produced by Gluconacetobacterxylinus isolated from Chinese persimmon vinegar /  R. Du, F. Zhao, Q. Peng, Z. Zhou, Y. Han. – DOI: https:// 10.1016/j.carbpol.2018.04.041 // CarbohydrPolym. – 2018. - Vol. 194. - P. 200-207.
7. Optimization of bacterial cellulose production by Koma gataeibacterxylinus PTCC 1734 in a low-cost medium using optimal combined design / Y. Raiszadeh-Jahromi, M. Rezazadeh-Bari, H. Almasi, S. Amiri. - DOI: https://10.1007/s13197-020-04289-6    // J Food SciTechnol. – 2020. -  Vol. 57 (7). -  P. 2524-2533.
8. Engineering control of bacterial cellulose production using a genetic toolkit and a new cellulose-producing strain / M. Florea, H. Hagemann, G. Santosa, J. Abbott, C.N. Micklem, X. [et al]. - DOI:  https://doi.org/10.1073/pnas.1522985113 //  ProcNatlAcadSci U S A. – 2016. – Vol 113. P. 3431-3440.