ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КРАСИТЕЛЕЙ С СЫВОРОТОЧНым АЛЬБУМИНом В ПРИСУТСТВИИ НАНОЧАСТИЦ МАГНЕТИТА

Бычкова Анна Владимировна

аспирант ФГБУН Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук, г. Москва

 E-mail: annb0005@yandex.ru

Сорокина Ольга Николаевна

канд. хим. наук, науч. сотр. ФГБУН Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук, г. Москва

Пронкин Павел Геннадьевич

канд. хим. наук, мл. науч. сотр. ФГБУН Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук, г. Москва

 E-mail: pronkip@gmail.com

Татиколов Александр Сергеевич,

д-р хим. наук, вед. науч. сотр. ФГБУН Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук, г. Москва

Коварский Александр Львович,

д-р хим. наук, проф., гл. науч. сотр. ФГБУН Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук, г. Москва

Розенфельд Марк Александрович,

д-р биол. наук, проф., зав. лаб. ФГБУН Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук, г. Москва

INTERACTION OF DYES WITH SERUM ALBUMINE IN PRESENCE OF magnetite nanoparticles

Anna Bychkova

Postgraduate student, Emanuel Institute of biochemical physics of RAS, Moscow

Olga Sorokina

Candidate of Chemical Sciences, Emanuel Institute of biochemical physics of RAS, Moscow

Pavel Pronkin

Candidate of Chemical Sciences, Emanuel Institute of biochemical physics of RAS, Moscow

Alexander Tatikolov

Doctor of Chemical Sciences, Emanuel Institute of biochemical physics of RAS, Moscow

Alexander Kovarski

Doctor of Chemical Sciences, Emanuel Institute of biochemical physics of RAS, Moscow

Mark Rosenfeld

Doctor of Biological Sciences, Emanuel Institute of biochemical physics of RAS, Moscow

Аннотация

В работе исследовалось взаимодействие органических красителей (полиметиновых и скварилиевых) с сывороточным альбумином, находящимся в составе белковых покрытий магнитных наночастиц.

Abstract

The interaction of organic dyes (polymethine and squarylium dyes) with serum albumin as a part of the protein coating on magnetic nanoparticles is investigated.

Ключевые слова: полиметиновые красители; сварилиевые красители; альбумин; магнитные наночастицы.

Keywords: Polymethine dyes; squarylium dyes; albumin; magnetic nanoparticles.

Авторы выражают благодарность Б.И. Шапиро (ГОСНИИХИМФОТОПРОЕКТ) и А.А. Ищенко (ИОХ НАНУ, Киев) за любезно предоставленные скварилиевые красители.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 12-03-31452, № 10-03-00647а).

В последние годы проводятся обширные исследования в области применения магнитных наночастиц (МНЧ) с биосовместимыми покрытиями [3]. Успех использования МНЧ в биологии и медицине во многом определяется функциональными свойствами компонентов их покрытий. Использование белков в составе покрытий МНЧ расширяет спектр возможностей наносистем. Вместе с тем, закрепление белковых покрытий на поверхности МНЧ представляет сложную научно-практическую задачу. Ранее был предложен принципиально новый способ создания устойчивого белкового покрытия, основанный на свойстве белков подвергаться поперечному сшиванию под действием свободных радикалов, которые генерируются на поверхности наночастиц под действием инициатора — пероксида водорода [1, 4].

Цель настоящей работы заключалась в изучении взаимодействия сывороточных альбуминов (в системах, содержащих наночастицы) с полиметиновым (ТКБ) и скварилиевым (СК) красителями. В дальнейшем полученные результаты планируется применить для разработки подходов к оценке функциональных свойств белка в составе покрытий МНЧ.

Экспериментальная часть

Синтез магнитных наночастиц и методика получения альбуминовых покрытий на поверхности МНЧ детально описаны в [1, 4]. МНЧ стабилизировали в водной дисперсии методом электростатической стабилизации фосфат-цитратным буфером с pH 4. В работе использовались коммерческие препараты белка (бычьего и человеческого сывороточного альбумина, БСА или ЧСА соответственно) фирмы «Sigma-Aldrich» (США). Контрольные образцы препаратов отличались от соответствующих опытных образцов отсутствием в реакционной системе пероксида водорода, вместо которого было добавлено эквивалентное количество дистиллированной воды («Контроль 1»), или наличием 0,01 мл аскорбиновой кислоты с концентрацией 152 мг/мл для генерации свободных радикалов в объеме реакционной системы («Контроль 2»).

Размеры синтезированных МНЧ и МНЧ в белковом покрытии оценивали методом динамического светорассеяния на спектрометре Zetasizer Nano-S фирмы Malvern (Англия). Количественные данные по адсорбции макромолекул альбумина на МНЧ получали с помощью метода ЭПР-спектроскопии спиновых меток [5].

Удаление свободного белка в образцах проводили путем осаждения МНЧ в покрытии сульфатом аммония при концентрации (NH₄)₂SO₄ 50 % и/или методом магнитной сепарации. Осадок подвергали ультразвуковому диспергированию в фосфатном буфере с pH 7,3.

В работе использовали красители-зонды, нековалентно взаимодействующие с альбумином в растворе [6, 7]: 3,3’-ди-(g-сульфопропил)-4,5,4’,5’-дибензо-9-этилтиакарбоцианин-бетаин (ТКБ), индолиевый скварилиевый краситель с сульфогруппами (СК).

Измерения спектров поглощения красителей проводились на спектрофотометре СФ-2000 (Россия), флуоресцентные измерения — на спектрофлуориметре «Флюорат-02-Панорама» (Россия) в стандартных кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см. При титровании растворов красителей раствором МНЧ концентрация красителя выбиралась в пределах (2—9)×10^—6 моль/л. При обработке спектров флуоресценции красителей учитывалось разбавление раствора красителя.

Результаты и обсуждения

Устойчивость альбуминового покрытия, закрепленного на поверхности МНЧ по свободнорадикальному механизму, была доказана совокупностью физико-химических методов: по конкурентному замещению альбумина фибриногеном [1, 2] методами электронного магнитного резонанса и динамического светорассеяния; по содержанию БСА в осадке, полученном после ультрацентрифугирования образца (контроль содержания проводился колориметрическим методом Бредфорда). Избирательность сшивания белка оценивали путем определения степени свободнорадикального окисления свободного белка в образцах «Опыт», «Контроль 1» и «Контроль 2» методом ИК-спектроскопии. Было доказано, что свободнорадикальное сшивание белка протекает избирательно на поверхности МНЧ и не затрагивает свободный белок в растворе [1].

Спектры поглощения красителя СК в водном растворе имеют максимум 624 нм, в присутствии бычьего сывороточного альбумина максимум спектров сдвигается в длинноволновую область на 16 нм. В присутствии альбумина и наночастиц, обработанных перекисью, максимум соответствует 629 нм. Спектры флуоресценции также демонстрируют похожее поведение: в водном растворе максимум спектра на 640 нм, в присутствии альбумина (2 мг/мл) спектр сдвигается (653 нм), в системе «Опыт» максимум на 648 нм (спектры не приведены).

В водном растворе краситель ТКБ находится главным образом в виде цис-димера (максимум спектра поглощения 535 нм), для красителя характерна низкая флуоресценция. В присутствии сывороточного альбумина человека образуется нековалентный комплекс транс-мономера красителя (максимум 612 нм). Большой спектральный сдвиг, высокая константа связывания (>10⁶ л/моль), высокий квантовый выход флуоресценции связанного с белком красителя (0,57), в то время как исходный краситель не флуоресцирует, делают данный краситель эффективным спектрально-флуоресцентным зондом на сывороточный альбумин человека [7].

Определение эффективной концентрации альбумина в образцах проводили методом флуоресцентного титрования красителя растворами «МНЧ — белок» относительно стандарта — образца «Контроль 1». В экспериментах были использованы системы, отличающиеся присутствием неадсорбированного на поверхности МНЧ белка и наличием свободнорадикальных сшивок белка на поверхности МНЧ (рис. 1). Показатель эффективной концентрации альбумина в нашем случае характеризует способность белка нековалентно взаимодействовать с флуоресцентным зондом.

Рисунок 1. Данные флуоресцентного титрования раствора

ТКБ (4.2×10^–6 моль/л) образцами: 1 — система «МНЧ — ЧСА», не подвергавшаяся радикальному сшиванию («Контроль 1»), 2 — система «МНЧ — ЧСА» после свободнорадикального сшивания в результате действия H₂O₂ («Опыт»), 3 — «Контроль 1» после удаления свободного белка. По оси абсцисс — количество образца, добавленного к 1 мл титруемого раствора.

После радикального сшивания альбумина на поверхности МНЧ флуорометрическое титрование красителями ТКБ показывает снижение значений эффективной концентрации ЧСА в образце. Так, например, при титровании раствора ТКБ образцами МНЧ, содержащими ЧСА, интенсивность сигнала флуоресценции связанного с белком красителя (590 нм) оказалась на 30 % меньше для образца подвергнутого сшиванию, по сравнению с образцом-стандартом (рис. 1, кривые 1 и 2).

Аналогичные результаты были получены в случае красителя СК для образцов, содержащих МНЧ и сшитый белок, обработанных сульфатом аммония. Титрование растворов МНЧ красителем показало низкую эффективную концентрацию альбумина.

Причиной снижения эффективной концентрации альбумина после проведения реакции радикального сшивания могут являться как окислительные повреждения связывающих центров альбумина (частичная денатурация), так и пространственная недоступность связывающих центров ЧСА для зонда. Значительное снижение показателя эффективной концентрации альбумина в результате удаления свободного альбумина может объясняться снижением доступности связывающих центров в результате адсорбции макромолекул на поверхности МНЧ, а, следовательно, изменением нативной функциональной активности белка при адсорбции.

Список литературы:

1.Бычкова А.В., Розенфельд М.А., Леонова В.Б., Сорокина О.Н., Ломакин С.М., Коварский А.Л. Модификация поверхности наночастиц магнетита в дисперсиях сывороточным альбумином методом свободнорадикального сшивания // Коллоидный журнал. 2013. № 1 (в печати).

2.Бычкова А.В., Сорокина О.Н., Коварский А.Л., Шапиро А.Б., Леонова В.Б., Розенфельд М.А. Взаимодействие фибриногена с наночастицами магнетита // Биофизика. 2010. Т. 55. № 4. С. 605—611.

3.Бычкова А.В., Сорокина О.Н., Розенфельд М.А., Коварский A.Л. Многофункциональные биосовместимые покрытия на магнитных наночастицах // Успехи Химии. 2012. № 11 (в печати).

4.Розенфельд М.А., Бычкова А.В., Сорокина О.Н., Коварский А.Л., Леонова В.Б., Ломакин С.М., Макаров Г.Г. Способ получения белковых покрытий на поверхностях твердых тел, содержащих ионы металлов переменной валентности // Заявка на получение патента РФ № 2011136972, приоритет от 08.09.2011.

5.Сорокина О.Н., Бычкова А.В., Шапиро А.Б., Тихонов А.П., Коварский А.Л. Применение метода спиновых меток к исследованию адсорбции макромолекул на магнитных наночастицах // Химическая физика. 2010. Т. 29. № 6. С. 87—91.

6.Татиколов А.С., Панова И.Г., Ищенко А.А., Кудинова М.А. Спектрально-флуоресцентное изучение взаимодействия скварилиевых красителей — производных 3Н-индолия - с альбуминами // Биофизика. 2010. Т. 55. № 1. С. 46—53.

7.Tatikolov A.S., Costa S.M.B. Complexation of Polymethine Dyes with Human Serum Albumine: A Spectroscopic Study // Biophys. Chem., 2004, v. 107, p. 33—49.