ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ ДЛЯ БИОРЕМЕДИАЦИИ ВОДНЫХ СРЕД

Шубаков Анатолий Александрович

канд. биол. наук, доцент Института физиологии Коми НЦ УрО РАН,

г. Сыктывкар

Е-mail: shubakov@physiol.komisc.ru

Шарапова Ирина Эдмундовна

вед. инженер Института биологии Коми НЦ УрО РАН,

г. Сыктывкар

Е-mail: scharapova@ib.komisc.ru

Михайлова Елена Андрияновна

науч. сотр. Института физиологии Коми НЦ УрО РАН,

г. Сыктывкар

Е-mail: elkina@physiol.komisc.ru

USE OF MICROALGAE FOR BIOREMEDIATION OF WATER ENVIRONMENTS

Anatoly Shubakov

Candidate of Biological Sciences, Associate Professor of Institute of Physiology, Komi Science Centre, The Urals Branch of the Russian Academy of Sciences,

Syktyvkar

Irina Sharapova

Leading engineer of Institute of Biology, Komi Science Centre, The Urals Branch of the Russian Academy of Sciences,

Syktyvkar

Elena Mikhailova

Researcher of Institute of Physiology, Komi Science Centre, The Urals Branch of the Russian Academy of Sciences,

Syktyvkar

АННОТАЦИЯ

Разработан биопрепарат на основе бактерий (Rhodococcus eqvi), дрожжевого (Rhodotorula glutinis) и мицелиального (Trichoderma viride) грибов, включающий также культуру зеленых микроводорослей Chlorella vulgaris, присутствие которой повышает эффективность биодеструкции нефтезагрязнений микробными культурами за счет обеспечения их кислородом. Разработаны способы удаления нефтезагрязнений с помощью комплексов из монокультур бактерий и грибов при применении совместно с сорбентом в нативной, а также в иммобилизованной на сорбенте формах в присутствии культуры микроводорослей.

ABSTRACT

The biopreparation on the basis of bacteria (Rhodococcus eqvi), yeast (Rhodotorula glutinis) and filamentous fungi (Trichoderma viride) is developed. It also includes a culture of green microalgae of Chlorella vulgaris which presence increases efficiency of an oil pollution biodestruction by germ cultures via providing them with oxygen. Ways of removal of oil pollution by bacteria and fungi monoculture complexes are developed with the use of sorbent in native and in sorbent immobilized forms in the presence of microalgae culture.

Ключевые слова: микроводоросли; бактерии; дрожжи; мицелиальные грибы; нефть; вода; биоремедиация.

Keywords: microalgae; bacteria; yeast; filamentous fungi; oil; water; bioremediation.

Загрязнение окружающей среды нефтью и продуктами ее переработки имеет место в районах нефтедобычи и транспортировки, которые в основном сосредоточены в северных регионах. В настоящее время предложен широкий спектр технологий с применением различных средств для очистки нефтезагрязненных водных объектов, в том числе с использованием биопрепаратов на основе природных углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ), а также сорбентов и биосорбентов (биопрепаратов, иммобилизованных на пористых носителях).

Установлено, что сложные микробные сообщества осуществляют с большей полнотой и скоростью окисление нефтяных углеводородов (НУГВ) в загрязненных водных средах и почвах, так как микроорганизмы в таких сообществах взаимодействуют и получают преимущества за счет совместной «метаболической атаки» на углеводороды [2]. Поэтому для получения активного биопрепарата наиболее актуальным является подбор микробных культур различных таксономических групп, составленных в комплексы в различном сочетании, с использованием микроорганизмов, выделенных из природы активных штаммов-нефтедеструкторов, а также устойчивых или адаптированных к условиям загрязненных объектов и способствующих биоокислению НУГВ. Использование комплексов микроорганизмов, на основе культур бактерий, водорослей, дрожжевых и мицелиальных грибов, с присущим подобного рода микробным сообществам многообразием метаболических связей, позволит расширить диапазон применения нефтедеструктивных биопрепаратов.

Проведенные нами исследования показали возможность биодеструкции углеводородов нефти в водных средах при совместном применении гидрофобного сорбента и микроорганизмов и водорослей различных таксономических групп. Для оценки эффективности комплексной формы препарата при очистке воды от углеводородов нефти в присутствии сорбента использовали нативные накопительные монокультуры бактерий, грибов и микроводорослей. В экспериментах применялись депонированные монокультуры: бактериальная Rhodococcus eqvi и дрожжевая Rhodotorula glutinis, мицелиальный гриб Trichoderma viride, культура зеленых микроводорослей Chlorella vulgaris Beijer, а также гидрофобный торфяной сорбент «Сорбонафт» (ТУ 0392-001-55763877-2003, ЗАО «Маркетинг-бюро», г. Киров). Микробные культуры и микроводоросли, использованные в исследованиях, представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Культуры микроорганизмов и микроводорослей

Примечание: КОЕ — колониеобразующая единица.

Обоснованием выбора культур послужили данные, что микроорганизмы таксономических групп отличаются различными метаболическими путями окисления н-алканов, что многие виды мицелиальных грибов рода Trichoderma способны окислять полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), а также данные об окислительной активности бактерий рода Rhodococcus и дрожжей рода Rhodоtorula, выделенных из нефтезагрязненных почв Республики Коми. Выбор культуры микроводорослей основан на том, что зеленые водоросли рода Chlorella более других отличаются устойчивостью не только к естественным факторам среды, но и к антропогенным факторам [3]. Несмотря на то, что отсутствует информация о полной деградации водорослями НУГВ, эти организмы способны изменить физическую и химическую природу токсикантов и сделать их более чувствительными к атаке другими микроорганизмами после удаления замещенных групп. Эта первоначальная трансформация может быть крайне важна для полной деградации загрязнителей в окружающей среде. Известно также, что выделяя кислород в процессе фотосинтеза, водоросли обеспечивают бактериальное окисление различных органических загрязняющих веществ. Благодаря этим процессам естественные воды обладают некоторой способностью амортизировать действие загрязняющих веществ, что и определяется понятием «самоочищение».

Нефть, сложнейшее химическое соединение, при попадании в воду образует продукты окисления, зачастую более токсичные, чем исходные вещества. Установлено, что наиболее высокой токсичностью для гидробионтов обладают нерастворимая составляющая нефти, токсичность которой зависит от размеров частиц эмульгированной нефти и температуры [7]. В проведенных исследованиях в качестве поллютантов использовали образцы сырой товарной нефти. Нефть тяжелая, с высоким содержанием парафинов и смолисто-асфальтовых веществ Возейского месторождения Усинского района Республики Коми. Учитывая, что углеводороды образуют пленку на водной поверхности, предполагается, что биодеструкция наиболее токсичных НУГВ обусловлена биохимической активностью нативных микроорганизмов на поверхности загрязненного сорбента в трехфазной системе вода — сорбент — НУГВ и сопровождается, очевидно, процессами адсорбции, десорбции и диффузии в порах сорбента. При этом эффективная биорегенерация сорбента (очистка сорбента от НУГВ) возможна при условии, когда нефтенагруженность или соотношение НУГВ к сорбенту не превышает его максимальной нефтеемкости.

Степень очистки воды и биорегенерации сорбента от НУГВ определена в отделенных фильтрованием воде и сорбенте по окончании опыта, продолжительность которого обусловлена периодом положительных температур на Севере (не более 3 месяцев). Бактериальная и грибные монокультуры (табл. 1), отобранные в предварительных опытах, получены на индивидуальных питательных средах и применялись совместно с микроводорослями в загрязненных нефтью водных средах (соответственно 2 % (15 г/л) нефти). Исследование по очистке водных сред провели с соотношением нефти и сорбента 2 мл : 2 г в течение 90 суток при естественном освещении. Монокультуры внесены по 1 % общим количеством от объема водной среды в различном сочетании. Общепринятыми методиками определены показатели: остаточное содержание нефтепродуктов (ОСНП) [4, 5]; дегидрогеназная активность в сорбенте [8]; титр и биомасса микроорганизмов [1]; ∑Са,Сb — сумма концентраций хлорофиллов а и b зеленых микроводорослей в воде [6].

По окончании опыта проанализированы отделенные фильтрованием пробы сорбента и водной среды. При совместном применении микробного комплекса и гидрофобного сорбента Сорбонафт биодеструкция НУГВ «свободными»-нативными и «прикрепившимися» к загрязненному сорбенту микроорганизмами оценивалась по показателям снижения содержания НУГВ в воде и сорбенте, общей микробной численности (ОМЧ), концентрации хлорофиллов микроводорослей (МВ), а также дегидрогеназной активности в сорбенте (АД). Активность микробных комплексов, составленных в различном сочетании, неодинакова в условиях загрязнения воды нефтью. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Результаты биодеструкции нефти в воде комплексом накопительных культур микроорганизмов и микроводорослей в присутствии гидрофобного сорбента

Примечание: 1 — общая численность микроорганизмов в воде (ОМЧ), млн. КОЕ/мл; 2 — концентрация хлорофиллов микроводорослей в воде ∑Ca,Cb, мг/л; 3 — степень биодеструкции НУГВ в воде, %; 4 — общая численность микроорганизмов в сорбенте (ОМЧ), млн. КОЕ/г сорбента; 5 — дегидрогеназная активность в сорбенте, мг ТФФ/1 г сорбента ч (ТФФ — трифенилформазан); 6 — степень биодеструкции НУГВ в сорбенте, %.

Показатели снижения содержания НУГВ в воде и сорбенте рассчитаны по отношению к контрольным вариантам — сорбент без микроорганизмов (С без м/о) при загрязнении воды нефтью. Наибольшим снижением содержания НУГВ в сорбенте отмечены варианты с внесением альго-бактериального, альго-дрожжевого, альго-бактериально-грибного комплексов накопительных культур при загрязнении водной среды нефтью (варианты № 2, 3, 6; табл. 2).

Общая численность микроорганизмов в сообществе на сорбенте была на один-два порядка ниже показателей ОМЧ в воде. В вариантах опыта на исходно инертном сорбенте к концу эксперимента численность микроорганизмов составила 10⁵—10⁶ КОЕ/1 г сорбента, что подтверждается нефтеокислительной ферментативной активностью прикрепившихся к сорбенту микроорганизмов. Показатели численности в воде незначительно преобладали над теми же показателями в сорбенте (10⁶—10⁸ КОЕ/мл). Доминировали по численности в микробном сообществе: в водной среде — микроводоросли Chlorella (МВ) и дрожжи R. glutinis (Д), в сорбенте — бактерии R. eqvi (Б).

Сорбент являлся «базой или матрицей» для нативных микроорганизмов. Эти данные обоснованы ферментативной активностью в сорбенте и микробиологическими показателями. По окончании опыта посредством определения дегидрогеназной активности определена биохимическая активность микробного сообщества в сорбенте. При совместном применении накопительных монокультур и сорбента дегидрогеназная активность нативных, а также «прикрепившихся» к загрязненному сорбенту микроорганизмов незначительна.

В результате проведенного опыта можно сделать вывод, что гидрофобный сорбент на основе торфа одновременно обеспечивал сорбцию НУГВ и стимулировал микробный метаболизм и биодеструкцию НУГВ за счет микроорганизмов, внесенных в водную среду в нативной форме или накопительными монокультурами, не иммобилизованными на носителе. Для биодеструкции в воде, загрязненной нефтью, наиболее эффективен комплекс из трех штаммов микроорганизмов: бактерий R. eqvi (Б) и зеленых микроводорослей Chlorella (МВ), а также дрожжевого R. glutinis (Д) или мицелиального T. viride (Г) грибов. Микроводоросли хлорелла способствовали биодеструкции НУГВ в загрязненных водных средах. Показано, что применение монокультур бактерий и зеленых микроводорослей, а также дрожжевого или мицелиального грибов позволяет увеличить их активность и потенциал в отношении деструкции углеводородов нефти при очистке пресноводной среды в присутствии гидрофобного сорбента. Проведенные исследования позволяют полагать, что помимо сорбции НУГВ решается вопрос биодеструкции НУГВ в водной толще и в массе сорбента, сохранившего при этом положительную плавучесть на водной поверхности в течение трех месяцев (90 % исходно внесенного количества сорбента, загрязненного нефтью).

Таким образом, при совместном применении в различном сочетании альго-бактериально-грибного комплекса нативных микроорганизмов и гидрофобного сорбента за 90 суток биорегенерация сорбента составила 33—50 % при загрязнении водной среды нефтью.

Работа выполнена при поддержке программы фундаментальных исследований УрО РАН, проект № 12-И-4-2007 «Биоресурсный потенциал и биохимическая оценка микроводорослей европейского северо-востока России в качестве объектов биотехнологии».

Список литературы:

1.Градова Н.Б., Бабусенко Е.С., Горнова И.Б., Гусарова Н.А. Лабораторный практикум по общей микробиологии. М., 1999. — 130 с.

2.Кураков А.В., Ильинский В.В., Котелевцев С.В., Садчиков А.П. Биоиндикация и реабилитация экосистем при нефтяных загрязнениях. М.: Графикон, 2006. — 336 с.

3.Ленова Л.Н., Ступина В.В. Водоросли в доочистке сточных вод. Киев: Наукова думка, 1990. — 182 с.

4.Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в пробах почв и грунтов флуориметрическим методом на анализаторе жидкости «Флюорат-02». ПНД Ф 16.1.21-98. — М., 1998. — 15 с.

5.Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в пробах природных, питьевых, сточных вод флуориметрическим методом на анализаторе жидкости «Флюорат-02». ПНД Ф 14.1:2:4.128-98. — М., 1998. — 15 с.

6.Методы физиолого-биохимического исследования водорослей в гидробиологической практике. Киев: Наукова думка, 1975. — 247 с.

7.Ратушняк А.А., Андреева М.Г., Латыпова В.З., Гарипова Л.Г. Токсическое действие нефти и продуктов ее переработки на Daphnia magna Straus // Гидробиол. журн. — 2000. — № 2 — С. 33—39.

8.Хазиев Ф.Х. Методы почвенной энзимологии. М.: Наука, 2005. — 252 с.