ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА И ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ Т-ЛИМФОМЫ У СОБАК

HISTOLOGICAL DIAGNOSIS AND DIFFERENTIATION OF T-LYMPHOMA IN DOGS

Zarima Jumakanova

esearcher of Kyrgyz National Agrarian University named after K.I. Scriabin

Kyrgyzstan, Bishkek

АННОТАЦИЯ

Целью данной научной работы являлся диагностика и дифференциация подтипов Т-лимфомы, количественный анализ индекса пролиферации и апоптоза клеток, выявление частоты, породности, половое, возрастное различие данного типа лимфомы среди домашних собак в Кыргызской Республике. Гистологическими и иммуногистохимическими методами исследования, с применением соответствующего маркера (CD3, SABC метод), в течении с 2011 по 2015 гг. в г. Бишкек диагностированы 11 случаев Т-лимфомы у собак и из них: 6 случаев дифференцировано – как плеоморфная смешенная, 2 – большая гранулярная, 1 – лимфобластная, 1 – грибовидный микоз и 1 случай – неопределенная Т-лимфома. Индекс пролиферации (Ki67) неопластических Т-клеток – 6 случаев показали высокую (21.4–86.7 %), 1 – среднюю (15.8 %) и 4 низкую (0–7%) степень злокачественности. Показатель апоптотических клеток (active Caspase-3) только в одном случае была высокая (46 %), а в других случаях не превышало 5 %. Т-лимфома диагностирована у ротвейлеров (2), французского бульдога (1), немецкой и азиатской овчарки (по 1), китайской хохлаты (1) и у беспородных (5). В возрастном отношении заболевают собаки до 5 лет (6) и старше (5), а в половом отношении самцы (9) заболевают чаще, чем самки (2).

ABSTRACT

The purpose of this research was the diagnosis and differentiation of subtypes of T-lymphoma, a quantitative analysis of the index of cell proliferation and apoptosis, detection frequency, breed, sex, age difference of this type of lymphoma among pet dogs in the Kyrgyz Republic. Histological and immunohistochemical methods of research, with application of marker CD3, SABC method, during 2011–2015 in Bishkek diagnosed 11 cases of T-lymphoma in dogs are: 6 cases of differentiated – as a pleomorphic mixing 2 – large granular 1 – lymphoblastic 1 – mycosis fungoides and 1 case – unspecified T-cell lymphoma. Index of proliferation (Ki67) neoplastic of T-cells – 6 cases showed high (21.4–86.7 %), 1 – the average (15.8 %) and 4 low (0–7 %), the level of malignancy. The index of apoptotic cells (active Caspase-3) in only one case was high (46 %) and in other cases not exceed 5 %. T-cell lymphomas were diagnosed in Rottweiler (2), French bulldog (1) German and Asian shepherds (1) Chinese crested (1) and mongrels (5). In regard to age suffered dogs to 5 years (6) and above (5), affected males (9) more often than the female (2).

Ключевые слова: Т-лимфома, диагностика и дифференциация, пролиферация и апоптоз, собака.

Keywords: T-lymphoma, diagnosis and differentiation, proliferation and apoptosis, dog.

Введение. Превращение Т-лимфоцитов в злокачественную форму называют Т-клеточной лимфомой. Т-лимфома у людей [9] и у собак [4; 5; 13] оценивается плохим прогнозом и короткой продолжительностью жизни больного. По течению развития Т-лимфосаркома бывает: агрессивной и индолентной.

T-клеточная лимфома встречается у собак от 1 до 12 лет, средний возраст 6,9 лет. Особенно к этой лимфоме предрасположена боксерская порода. У собак заболевших лимфомой отмечается – вялость, слабость, снижение веса, увеличение периферических лимфатических узлов, поражение кожного покрова, полиурия, полидипсия [7].

В литературных источниках встречаются исследования, посвященные эпителиотропной [1], крупноклеточной [10], лимфобластной [11], мелкоклеточной [7], плеоморфной [7] и алиментарной [2; 8; 13; 14; 15] Т-лимфоме у людей и собак.

При грибовидном микозе и мелкоклеточной Т-лимфоме отмечаются генерализованная лимфаденопатия [7]. По данным исследователей у заболевших людей и у собак с грибовидным микозом наблюдаются одинаковые микроскопические альтерации [3]. У собак, как и у людей, плеоморфные лимфоидные опухолевые клетки инфильтрируется в эпидермис и поверхностный слой дермы кожи.

Прогноз Т-клеточной лимфомы кожи неблагоприятный и даже при длительном лечении с дорогостоящей химиотерапией новообразование не лечиться [6].

Несмотря на множества исследовательских материалов по Т-лимфоме собак, многие вопросы этиологии и генетики лимфомы остаются открытыми, а в Кыргызстане подобные диагностические исследования данной патологии не проводились.

Цель и задачи исследования. Целью данной научной работы являлся диагностика и дифференциация подтипов Т-лимфомы, количественный анализ индекса пролиферации и апоптоза клеток, выявление частоты, породности, половое, возрастное различие данного типа лимфомы среди домашних собак в Кыргызской Республике. В соответствии с целью, перед нами были поставлены нижеследующие задачи:

• микроскопическим методом исследования диагностировать лимфому собак;
• ИГХ методом исследования проводит дифференциальную диагностику (фенотипирование) Т-лимфомы у собак;
• проводит анализ частоты заболеваемости Т-лимфомой среди различных пород, возраста и пола животного;
• проводит количественный анализ индекса пролиферации и апоптоза среди разных подтипов лимфомы у собак.

Материал и методы исследования. Работа выполнялась на кафедре ветеринарно-санитарной экспертизы, гистологии и патологии КНАУ им. К.И. Скрябина. Материал набирался в ветеринарных клиниках г. Бишкек в течение 2011–2015 гг.

Биопсионный материал получен от 240 случаев с новообразованием собак, из них 11 диагностирован и иммунофенотипирован как Т-лимфома.

Полученные тканевые пробы фиксировались в 10 % ном водном растворе нейтрального формалина. Обезвоживание, просветление и уплотнение кусочков производилась в специальной машине карусельного типа Automatic tissue processor LeicaTP 1020. Приготовление парафиновых блоков выполнялась с помощью аппарата Leica EG1150. Серийные срезы готовились на автоматическом микротоме Rotary Microtome Leica RM2255 толщиной 2–5 мкм. Для общего анализа, полученные гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином.

Для иммуногистохимических окрашиваний срезов восстановление антигена производили с помощью рисоварки (20 минут, +90–100⁰С) при использовании антиген восстанавливающих буферных растворов (EDTA (PH 9.0) или цитратный буфер (PH 6.0)) в соответствии с протоколом окраски.

Для выявления Т-лимфоцитов использовали антитело – Polyclonal Rabbit Anti-Human T cell, CD 3. Code No. A. 0452; для выявления пролиферации клеток – антитело Monoclonal Mouse Anti-Human Ki67. Clone MIB-1; для выявления апоптоза клеток - антитело Monoclonal Rabbit Anti-Human (Aps 175) active Caspase 3 и использовали SABC (Streptavidin and Biotinylated horseradish peroxidase macro molecular Complex) метод иммуногистохимии.

Срезы дополнительно окрашивали гематоксилином Майера, дифференцировали 1 % раствором соляной кислоты на 70⁰ном спирте.

При классификации Т-лимфомы нами использована обновленная Киль классификация (Updated Kiel classification, 2002), так как она основана на морфологических данных клетки и на данные иммунофенотипирование.

Изучения индекса пролиферации и апоптоза атипичной лимфоидной ткани при разных фенотипах и подтипах лимфом собак, необходимо для определения степени злокачественности и прогнозирования болезни. Исходя из этой цели нами выполнено количественный анализ атипичных пролиферативно-активных клеток и клеток в состоянии апоптоза. Количество позитивных и негативных клеток подсчитывали вручную, а сам процесс количественного анализа проводили следующим образом: из четырех разных участков получали микрорисунки одного размера и увеличения (х250). Позитивные и негативные клетки на Ki67 или Caspase 3 подсчитывали вручную с помощью компьютерной программы Paint и все подсчитанные клетки обрабатывали с помощью компьютерной программы Microsoft Excel 2010, где получали общую количеству подсчитанных клеток, количеству негативных и позитивных клеток, и средний процентный показатель по конкретному случаю.

Результаты исследования. В данной научной работе гистологическими и иммуногистохимическими методами исследования диагностированы и дифференцированы 11 случаев Т-лимфомсаркомы у собак. В результате нами получены нижеследующие подтипы Т-лимфосаркомы, что указано на рисунок 1.

Рисунок 1. Количественное и процентное соотношение подтипов Т-лимфосаркомы собак диагностированные в Бишкеке с 2011 по 2015 гг.

Микроскопически плеоморфная смешенная Т-лимфома характеризуется диффузной инфильтрацией мелкими, средними и большими клетками с ядрами неправильной формы и светлой цитоплазмой. Их ядра в основном имели эксцентричное расположение, лишь в незначительных атипичных лимфоцитах они имели центральное расположение. Формы ядер – округлая, удлиненно-овальная, неправильно четырех- или шестиугольная. Хроматин имел глыбчатую структуру, а в единичных клетках он уплотнен. Ядра имели несколько ядрышек, отдельные из них окрашивались в розовый цвет. Границы клеток четко просматривались.

По количественному соотношению малых, средних и больших лимфоцитов плеоморфная Т-лимфома нами классифицировано как плеоморфная смешенная, где они сравнительно в одинаковом количестве, плеоморфная мелко- и крупно клеточная, где преобладают количество малых и больших лимфоцитов и плеоморфная мелкоклеточная. В рисунке 2 приведен пример плеоморфной мелко- и крупноклеточной Т-лимфомы собаки. Все 11 случаев подтверждены маркером иммуногистохимии анти CD3 (рис. 2 Б и 2 В), анализирован интенсивность окраски, в количественном и качественном отношении, пролиферативно-активных клеток (рис. 2 В и 2 Г) и клеток в состоянии апоптоза (рис. 2 Г).

Рисунок 2. Парафиновый срез тощей кишки собаки с плеоморфной мелко- и крупноклеточной Т лимфомой.

А – локализация злокачественных лимфоцитов в слизистой оболочке органа. Отмечались единичные гигантские клетки (указаны стрелкой). Гематоксилин и эозин. х250;

Б – злокачественные CD3 позитивные клетки. Polyclonal Rabbit Anti-Human Tcell, CD 3. Code No. A. 0452. SАВС метод. х250;

В – незначительное количество злокачественных Ki67 позитивных лимфоцитов. Monoclonal Mouse Anti-Human Ki67. Clone MIB-1. SАВС метод. х250;

Г – единичные Caspase-3 позитивные клетки. Monoclonal Rabbit Anti-Human active Caspase-3. Aps 175. SАВС метод. х250

Большая гранулярная Т-лимфома в основном представлена большими округло-овальными или неправильной формы атипичными лимфоцитами. В цитоплазме атипичных лимфоцитов отмечаются гранулярные структуры, которые окрашиваются в фиалетово-красный (азурофильные) цвет, они мелкие или сравнительно крупные (рис. 3 Б).

Лимфобластная форма Т-лимфомы представлена диффузно-инфильтративными незрелыми бластными клетками со скудной цитоплазмой, уплотненным (сгущенным) хроматином, свёрнутой спиралью ядерной мембраной, нечетко выраженными ядрышками. Формы ядер атипичных клеток овальные, округлые или неправильно удлиненные.

Рисунок 2. Парафиновый срез кожи собаки большой гранулярной Т-лимфомой.

А – глубокая деструктизация эпидермиса и дермы кожи. Гематоксилин и эозин. х62,5;

Б – злокачественные крупные атипичные лимфоциты в дерме. Гематоксилин и эозин. х250;

В – злокачественные CD3 позитивные клетки. Polyclonal Rabbit Anti-Human T cell, CD 3. Code No. A. 0452. SАВС метод. х250;

Г – злокачественные Ki67 позитивные лимфоциты. Monoclonal Mouse Anti-Human Ki67. Clone MIB-1. SАВС метод. х250

Грибовидный микоз характеризуется эпидермальными и интрадермальными абсцессами с примесью атипичных клеток. Выявлены в малом количестве атипичные клетки с церебриформными ядрами. Но из разнородной массы клеток значительное количество клеток относилось к «микозным клеткам» – это атипичные лимфоидные клетки с крупными хорошо окрашенными ядрами, неправильной формы. Встречались крупные полиморфные клетки с мульти дольчатыми ядрами и ободком базофильной цитоплазмы. Отмечалась скрученность ядер, а местами азурофильные цитоплазматические гранулы и полиморфизм атипичных неопластических клеток.

Один случай дала положительную реакция на маркер CD3, но мы не смогли ее дифференцировать его согласно обновленной Киль классификации (Updated Kiel classification, 2002) и определили как Т-лимфома неопределенной формы.

Индекс пролиферации (Ki67) неопластических Т-клеток – 6 случаев показали высокую (21.4–86.7 %), 1 – среднюю (15.8 %) и 4 низкую (0–7 %) степень злокачественности. Показатель апоптотических клеток (active Caspase-3) только в одном случае была высокая (46 %), а в других случаях не превышало 5 %.

Результаты наших исследований показали, что Т-лимфома диагностирована: у ротвейлеров – 2 случая, французского бульдога – 1, немецкой – 1, азиатской овчарки – 1, китайской хохлаты – 1 и у беспородных 5. В возрастном отношении Т-лимфомой заболевают собаки до 5 лет (6 случаев) и старше (5 случаев), а в половом отношении самцы (9 случаев) заболевают чаще, чем самки (2 случаев).

В заключении можно отметить, что точная диагностика, дифференциация, определение степени злокачественности и прогнозирование Т-лимфомы у собак достигается комплексно-клиническими, патоанатомическими, патогистологическими и иммуногистохимическими (маркеры – CD3, Ki67, Caspase-3) методами исследования.

Выводы.

1.В Кыргызской Республике, в г. Бишкек, с 2011 по 2015 годы диагностировано и фенотипировано 11 случаев Т-лимфомы собак: это – плеоморфная смешанная (55 %), большая гранулярная (18 %), лимфобластная (9 %), грибовидный микоз (9 %), и неопределенная форма Т-лимфомы (9 %).

2.Определение индекса пролиферации и апоптоза при Т-лимфоме служить показателем злокачественности и прогнозирования данной патологии.

3.Т-лимфома идентифицировано в 6 случаях у беспородных и 5 случаях породистых собак. В возрастном отношении собаки заболевают Т-лимфомой одинаково, а в гендерном самцы болеют чаще (9 случаев), чем самки (2 случаев).

Список литературы:

1. Campbell H.L., Weeks J.R., Hagan A.K. Impact of strip-till into various cover crops on disease development and yield in peanut // Phytopathology, 2004. 94: S. 13. 

2. Coyle K., Steinberg H. Characterization of lymphocytes in canine gastrointestinal lymphoma // Vet Pathol., 2004. 41: 141–146. 

3. Day M.J. Immunophenotypic characterization of cutaneous lymphoid neoplasia in the dog and cat // J Comp Pathol., 1995. 112: 79–96. 

4. Dobson J., Samuel S., Milstein H., Rogers K., Wood J. Canine neoplasia in the UK: estimates of incidence rates from a population of insured dogs // Journal of Small Animal Practice, 2002. 43: 440–446.

5. Dobson J.M., Blackwood L.B., Mc. Innes E.F., Bostock D.E., Nicholls P., Hoather T.M., Tom B.D. Prognostic variablein canine multicentric lymphosarcoma // Journal of Small Animal Practice, 2001. 42: 377–384.

6. Fontaine J., Bovens C., Bettenay S., Mueller R. Canine cutaneous epitheliotropic T-cell lymphoma review // 2008 DOI: 10.1111/j.1476-5829.2008.00176.

7. Fournel-Fleury C. et al. Canine T-cell lymphomas: a morphological, immunological, and clinical study of 46 new cases // Vet Pathol., 2002. 39: 92–109.

8. French R.A., Seitz S.E., Valli V.E. Primary epithelio-tropic alimentary T-cell lymphoma with hepatic involvement in a dog // Vet Pathol., 1996. 33: 349–352.

9. Jaffe E.S. Surgical Pathology of the Lymph Nodes and Related Organs // 2nd ed., PA Saunders, Philadelphia, PA, 1995.

10. Kaldrymidou E. et al. Malignant lymphoma in nasal cavity and paranasal sinuses of a dog // J Vet Med A Physiol Pathol Clin Med., 2000. 47(8): 457–62.

11. Nathwani B.N. et al. Lymphoblasticlymphoma. A clinicopathologic study of 95 patients // Cancer, 1981.48: 2347–2357. 

12.& Phillips B.S. et al. Apoptotic and proliferation indexes incanine lymphoma // Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 2000. 12: 111–117.

13. Shepherd N.A. et al. Malignant lymphoma with eosino-philia of the gastrointestinal tract // Histopathology, 1987. 11: 115–130.

14.  Steinberg H., Dubielzig R., Thomson J., Dzata G. Primary gastrointestinal lymphosarcoma with epitheliotropism in three Shar-pei and one boxer dog // Vet Pathol., 1995. 32: 423–426.

15. Valli V.E., Jocobs R.M., Parodi A.L.. Histoligical classification of hamatopoietic tumors of domestic animals // Armed Forces Institution of Pathology and the World Health Organization: Washington, D.C. 2002.