КЛОНИРОВАНИЕ И СЕКВЕНИРОВАНИЕ УЧАСТКА ГЕНА КАТАЛАЗЫ PENICILLIUM ADAMETZII

CLONING AND SEQUENCING OF CATALASE-ENCODING GENE SITE OF PENICILLIUM ADAMETZII

Yauhenia Martynova

student of biological faculty of BSU,

Belarus, Minsk

Tatiana Semashko

ph.D., leading researcher of Institute of Microbiology, National Academy of Sciences of Belarus,

Belarus, Minsk

Valentovich Leonid

ph.D., head of laboratory CAGES of Institute of Microbiology, National Academy of Sciences of Belarus,

Belarus, Minsk

АННОТАЦИЯ

С целью последующей инактивации гена каталазы Penicillium adametzii выделен участок данного гена, определена его нуклеотидная последовательность, проведен сравнительный анализ с генами каталазы грибов рода Penicillium. Данный участок гена cat P. adametzii идентичен участкам генов cat грибов P. chrysgenum Wisconsin 54-1255, P. digitatum Pd1, P. citrinum, P. marneffei ATCC 18224 на 81–97 %.

ABSTRACT

The gene site encoding catalase of Penicillium adametzii was isolated for further inactivation, its nucleotide sequence was determined and comparative analysis vs other catalase genes of Penicillium fungi was performed. The gene site cat of P. adametzii was identical site of genes cat P. chrysgenum Wisconsin 54-1255, P. digitatum Pd1, P. citrinum, P. marneffei ATCC 18224 (81–97 %).

Ключевые слова: Penicillium adametzii; ген каталазы; плазмида pJET1.2; клонирование; секвенирование.

Keywords: Penicillium adametzii; catalase gene; plasmid pJET1.2; cloning; sequencing.

Введение. Глюкозооксидаза (КФ 1.1.3.4) – один из практически значимых ферментов. Она является одним из основных компонентов биосенсоров, предназначенных для установления концентрации глюкозы в крови и других биологических жидкостях.

В лаборатории ферментов Института микробиологии выделен гриб Penicillium adametzii – активный продуцент глюкозооксидазы. С его использованием на базе Биотехнологического центра Института производится ферментный препарат. На основе препарата уже выпущено и реализовано более 3 млн. датчиков для экспресс-анализа концентрации глюкозы в крови у лиц с сахарным диабетом. Возрастающие объемы потребления глюкозооксидазы ставят задачу повышения объемов производства фермента и, соответственно, повышения выхода фермента при микробиологическом синтезе.

Важной проблемой при производстве данного фермента является сопряженный синтез продуцентами глюкозооксидазы каталазы. Ее трудно отделить от глюкозооксидазы при очистке, так как субъединицы глюкозооксидазы и каталазы практически не отличаются по молекулярной массе. Присутствие каталазы в препаратах глюкозооксидазы мешает при определении концентрации глюкозы биосенсорами. Поэтому в разработанной нами технологии получения препарата глюкозооксидазы мы вынуждены прекращать ферментацию с началом синтеза каталазы. При этом мы получаем культуральную жидкость без каталазы, но не полностью реализуем потенциал продуцента (выход целевого продукта ниже в 2–3 раза от максимально возможного).

Решение данной проблемы заключается в реализации метода направленной инактивации гена, который широко используется для изучения функции и роли отдельных генетических детерминант в развитии заболеваний животных и человека.

Цель данной работы – создать генетическую конструкцию, несущую участок гена каталазы (саt) P. adametzii, на основе плазмидного вектора pJET1.2, провести трансформацию полученного вектора в клетки бактериального штамма E. coli XL-1 Blue, определить нуклеотидную последовательность данного участка гена.

Материалы и методы исследования. В работе использовали ДНК мицелиального гриба P. adametzii [3, с. 210], бактериальные клетки Е. coli XL-1 Blue [4, с. 376], а также плазмиду pJET1.2 [5] из коллекции лаборатории ЦАГИИ (Центр аналитических и генно-инженерных исследований Института микробиологии НАН Беларуси).

Геномную ДНК P. adametzii получали набором для выделения ДНК «Нуклеосорб» (комплектация «С») (Праймтех) согласно инструкции фирмы-изготовителя.

Бактериальные клетки E. coli XL-1 Blue выращивали в жидкой и агаризованной средах LB [2, с. 390]. Для отбора трансформантов в работе использовали ампициллин в концентрации 100 мкг/мл.

Реакционная смесь для ПЦР содержала: 0,1–0,8 мкг тотальной ДНК в конечном объеме; 0,2 мкМ каждого из пары праймеров; 0,4 единицы Diamant-полимеразы (Институт микробиологии НАН Беларуси) и соответствующий ей буфер (8 мкл), содержащий 3,75 мМ MgCl₂ и 0,5 мМ дНТФ. Объем реакционной смеси составлял 20 мкл.

Праймеры, использованные в данной работе, были подобраны к небольшому участку гена cat на основе известных нуклеотидных последовательностей грибов рода Penicillium с использованием базы данных GenBank. Праймеры были синтезированы в ОДО «Праймтех» (Беларусь): fcat2 (5'-GATTTCATCTTCCGCCAGAAGATCCA-3') и rcat3 (5'-CCGTGACCGGGCATTGCCAC-3').

Амплификацию фрагмента гена cat проводили по общепринятому методу [1, с. 20–23]. Для проведения ПЦР использовали следующие режимы: 95^оС – 5 мин (1 цикл); 95^оС – 30 сек, 59^оС – 1 мин, 72^оС – 2 мин (30 циклов); 72^оС – 10 мин (1 цикл). Ожидаемый размер ПЦР-продукта составляет 568 п.о.

Продукт амплификации после электрофоретического разделения [1, с. 36–37] выделяли из агарозного геля с использованием набора для выделения ДНК «Нуклеосорб» (комплектация «G») (Праймтех). Выделенный ампликон клонировали в плазмиду pJET1.2. Полученной конструкцией трансформировали штамм E. coli XL-1 Blue методом электропорации с помощью прибора MicroPulser BIO-RAD (США).

Выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток E. coli XL-1 Blue проводили методом щелочного лизиса [1, с. 42–43].

Сиквенс-анализ проводили по методу Сенгера с помощью автоматического секвенатора 4300 DNA Analyzer (Li-COR Biosciences). Матрицей для секвенирующей реакции служила плазмидная ДНК pJET1.2-cat. Для проведения сиквенса был использован набор реактивов «DNA Cycle Sequencing Kit» («Jena Bioscience», PCR-401S) и стандартные секвенирующие праймеры к вектору pJET1.2 (pJET-F и pJET-R), меченые флуоресцентной меткой Cy5.5 (Праймтех).

Выделение плазмидной ДНК pJET1.2-cat для сиквенс-анализа проводили с использованием набора GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit (ThermoScientific) согласно методике производителя.

Полученные данные анализировали с помощью компьютерных программ eSeqTM DNA Sequencing Software Version 3.1.10 (Li-COR Biosciences), BLASTN2.2.1 (NCBI сайт: http://www.ncbi.nlm.nih.gov), .SnapGene Viewer Version 3.1.2.

Результаты и их обсуждение. Для выделения искомого фрагмента гена cat P. adametzii были использованы праймеры fcat2 и rcat3, подобранные к небольшому участку гена размером ≈ 568 п.о. В последовательности праймеров не были искусственно введены сайты рестрикции, поэтому для проведения ПЦР использовали Diamant-полимеразу. Diamant-полимераза способна синтезировать молекулы ДНК с тупыми концами, что дало возможность клонировать ПЦР-продукт в плазмидный вектор pJET1.2 для последующего сиквенс-анализа нуклеотидной последовательности участка гена cat P. adametzii.

В результате ПЦР был получен продукт амплификации размером ≈ 570 п.о., что полностью соответствует ожидаемому результату (рисунок 1).

Рисунок 1. Электрофореграмма фрагмента ДНК гена cat P. adametzii, амплифицированного с использованием праймеров fcat2, rcat3 на матрице тотальной ДНК, выделенной из мицелия P. adametzii (1 – маркер «Jena bioscience» (Германия); 2 – продукт амплификации гена cat P. adametzii

На следующем этапе работы провели клонирование полученного участка гена cat P. adametzii в плазмидный вектор pJET1.2. Полученная генетическая конструкция была введена в Е. coli XL-1 Blue. Затем из трансформантов выделили рекомбинантный вектор, созданный на основе плазмиды pJET1.2, несущий встроенный участок гена cat P. adametzii. В настоящей работе полученная гибридная конструкция была обозначена как pJET1.2-cat.

Для подтверждения полученных результатов провели рестрикционный анализ плазмиды pJET1.2-cat по сайтам рестрикции PstI, НindIII, BglII в условиях, рекомендуемых фирмой-производителем “ТhermoScientific” (Литва). После проведения линеаризации pJET1.2-cat по уникальному сайту рестрикции PstI размер плазмидной ДНК составил 3542 п.о (рисунок 2). В случае с одновременным использованием рестриктаз PstI и HindIII образовалось два фрагмента: ≈1200 п.о. и ≈2300 п.о. При рестрикции плазмиды pJET1.2-cat при помощи рестриктазы BglII (в данной плазмиде имеет два сайта рестрикции) вырезается фрагмент в ≈600 п.о. Полученные данные полностью соответствуют ожидаемым результатам.

Рисунок 2. Электрофореграмма рекомбинантной плазмиды pJET1.2-cat, линеаризованной по сайту рестрикции PstI (1); по сайтам рестрикции PstI и HindIII (2); по сайту рестрикции BglII (4); исходная (3); маркер молекулярного веса (5)

Был проведен сиквенс-анализ нуклеотидной последовательности фрагмента гена cat P. adametzii, имеющего размер 568 п.о. Рестрикционная карта целевого участка гена представлена на рисунке 3.

При проведении сравнительного анализа полной нуклеотидной последовательности участка гена cat P. adametzii, амплифицированного с использованием праймеров fcat2 и rcat3, подобранных к целевому фрагменту гена, было установлено, что секвенированный участок гена cat P. adametzii идентичен участкам генов cat грибов P. chrysogenum Wisconsin 54-1255, P. digitatum Pd1, P. citrinum, P. marneffei ATCC 18224 (на 81–97 %), депонированных в GenBank NCBI (AM920431.1, XM_014675429.1, DQ288844.1, XM_002153565.1 соответственно).

Рисунок 3. Рестрикционная карта участка гена cat P. adametzii

При сравнении нуклеотидной последовательности фрагмента кодирующего участка exon 1 с нуклеотидными последовательностями грибов рода Penicillium удалось установить сходство на 93 % с P. chrysogenum (XM_002561440.1), на 92 % с P. digitatum (XM_014675429.1), на 91 % с P. citrinum (DQ288844.1) и P. marneffei (XM_002153565.1).

Анализ нуклеотидной последовательности кодирующего участка exon 2 показал наибольшую идентичность с нуклеотидной последовательностью участка гена cat P. citrinum (DQ288844.1) (91 %).

Анализ нуклеотидной последовательности фрагмента кодирующего участка exon 3 показал 100 % степень гомологии с нуклеотидными последовательностями участков генов cat грибов P. digitatum (XM_014675429.1) и P. chrysogenum (XM_002561440.1).

Заключение. Таким образом, полученная в результате настоящей работы последовательность участка гена cat в дальнейшем будет использована для создания вектора инактивации гена cat 1, что позволит оптимизировать получение глюкозооксидазы.

Список литературы:

1. Лагодич А.В., Лагодич О.В. Методы анализа нуклеиновых кислот: учеб.-метод. пособие для студентов биол. фак. Минск: Изд-во БГУ, 2013. – 47 с.
2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное лонирование. – Пер. с англ. [под ред. ак. А.А. Баева и д-р биол. наук К.Г. Скрябина]. – М.: Мир, 1984 – 480 с.
3. Михайлова Р.В., Жуковская Л.А., Лобанок А.Г. Изучение спонтанной изменчивости Penicillium adametzii ЛФ F-2044 – продуцента глюкозооксидазы // Прикладная биохимия и микробиология. – 2007. – Т. 43, № 2. – С. 209–211.
4. Bullock W.O., Fernandez J.M., Short J.M. XL1-Blue: a high efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli strain with β-galactosidase selection // BioTechniques. – 1987. – Vol. 5. – P. 376–378.
5. Plasmid Files. pJET1.2/blunt // SnapGene – [Электронный ресурс]. – Режим доступа. – URL: http://www.snapgene.com/resources/plasmid_files/basic_cloning_vectors/pJET1.2_blunt/ (Дата обращения: 10.10.2015).