СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СОРБЕНТОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В СОСТАВЕ БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВЫ ОТ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕНИЙ

COMPARATIVE PERFOMANCE OF SORBENTS, USED IN THE COMPOSITION OF BIOLOGICAL PRODUCT FOR PURIFICATION SOIL OF OIL-CONTAMINATED

Ekaterina Konovalova

master student of the Department of Microbiology, Vyatka State University,

Russia, Kirov

Aleksey Lazykin

candidate of Biological Sciences, assistant professor of Vyatka State University, Russia, Kirov

Konstantin Gavrilov

candidate of Biological Sciences, assistant professor of Vyatka State University, Russia, Kirov

Ilya Darmov

doctor of Biological Sciences, Head of the Department of Microbiology, professor of Vyatka State University,

Russia, Kirov

АННОТАЦИЯ

Объектом исследования являются природные и искусственные материалы, применяемые в качестве сорбентов нефти. Целью настоящей работы являлась сравнительная оценка различных материалов, используемых в качестве сорбентов нефти и нефтепродуктов для создания биопрепаратов на их основе. Анализ осуществлялся по комплексу параметров, включающих как сорбционные характеристики образцов, так и физические, экономические, экологические свойства, а также способность к иммобилизации на их поверхности микроорганизмов-нефтедеструкторов. Наряду с традиционными гравиметрическими методами применялась концентратометрия с использованием ИК-спектрометрического концентратомера нефтепродуктов АН-2 и определялась интегральная токсичность образцов при помощи биолюминометра Биотокс-10М.

Использовались классические микробиологические методы, а также методы статистической обработки экспериментальных данных.

ABSTRACT

The object of investigation is natural and artificial materials used as oil sorbents. The aim of this study is the comparative evaluation of the various materials used as the oil sorbents and petroleum products to generate biological products based on them. Analysis have been carried out by a complex parameter including the sorption characteristics of samples, and physical, economic, environmental properties, and the ability to immobilize of the oil destructors microorganisms on the sorbents surface.

Concentrametry using infrared spectrometry concentrameter petroleum products AN-2 have been used along with the traditional gravimetric methods, as well as integrated toxicity of the samples have been determined using bioluminometer Biotoks-10M.

We have used the classical microbiological methods, as well as statistical treatment of experimental data.

Ключевые слова: биоремедиация; сорбция; углеводородокисляющие микроорганизмы; иммобилизация; биосорбент; биопрепарат.

Keywords: bioremediation; sorption; hydrocarbon-oxidizing microorganisms; immobilization; biosorbent; biological product.

Нефть относится к наиболее интенсивно используемым природным полезным ископаемым. С одной стороны, нефть и нефтепродукты обладают свойствами ценного и важнейшего сырья, а с другой стороны – опасного для человека и окружающей природной среды вещества.

В связи с увеличением количества чрезвычайных ситуаций, которое обусловлено ростом добычи нефти, износом основных производственных фондов (в частности, трубопроводного транспорта), негативное воздействие разливов нефти на окружающую среду становится все более существенным. Аварийные разливы нефти и нефтепродуктов, имеющие место на объектах нефтедобывающей и нефтеперерабатывающей промышленности, при транспорте этих продуктов наносят ощутимый вред экосистемам, вплоть до экологических катастроф, приводят к негативным экономическим и социальным последствиям [2].

Экологические последствия при этом носят трудно учитываемый характер, поскольку нефтяное загрязнение нарушает многие естественные циклы и взаимосвязи, существенно изменяет условия обитания всех видов живых организмов и накапливается в биомассе.

Следует отметить, что довольно часто происходят случаи выбросов и разливов нефти, которые не отражаются в статистике. Так, например, в настоящее время на территории России ежегодно происходит более 20 тысяч официально зарегистрированных аварий, сопровождающихся значительными разливами нефти. Объемы среднего разлива колеблются от 3 до 20 кубических метров. Однако, на самом деле эти цифры представляются заниженными. Чаще всего это связано с тем, что в соответствии с действующими нормативными правовыми актами Российской Федерации все разливы нефти и нефтепродуктов подразделяются по массе на чрезвычайные ситуации и не чрезвычайные ситуации без внимательного учета характера и особенностей проявления со временем негативных последствий [12].

Несмотря на проводимую в последнее время государством политику в области предупреждения и ликвидации последствий аварийных разливов нефти и нефтепродуктов, данная проблема остается актуальной и в целях снижения возможных негативных последствий требует особого внимания к изучению способов локализации, ликвидации и к разработке комплекса необходимых мероприятий [7].

Для решения данной проблемы требуются надежные и вместе с тем дешевые средства и методы. На фоне используемых для данных целей физических, химических и механических методов и приемов, биотехнологические отличаются своей эффективностью, экономичностью и экологической безопасностью. Применение в процессе очистки загрязненных территорий биопрепаратов содержащих живые микробные клетки микроорганизмов – биодеструкторов (биоремидиация) позволяет интенсифицировать процессы самоочищения в почве не вызывая для нее дополнительного ущерба.

В настоящее время заинтересованные организации активно занимаются разработкой и внедрением в практику эффективных технологий биоремедиации почв, загрязненных токсичными химическими соединениями. Проводится поиск и выделение из природной среды микробных изолятов нефтеокисляющих микроорганизмов, из которых создаются различные консорциумы и биопрепараты, способные при определенных условиях снижать содержания экотоксикантов в почве до безопасного уровня.

Одним из биотехнологических приемов, повышающим эффективность биодеструкции нефтяных загрязнений в почве является применение биопрепаратов, в которых клетки микроорганизмов-биодеструкторов иммобилизованы на биодеградируемом носителе. Использование носителя удерживающего микробы позволяет повысить стабильность их воздействия на токсикант в почве, а также увеличить длительность пребывания биопрепарата в месте введения в почву, что особенно важно в случае его применения при выпадении природных осадков. Кроме того, носитель способен выполнять роль структурообразователя почв, разрыхляющих и улучшающих их структуру, обеспечивающих лучшее проникновение в почву влаги и воздуха.

Цель работы состоит в сравнительном изучении сорбентов в составе биопрепаратов, применяемых для интенсификации процесса очистки почвы от нефтезагрязнений.

Первоначально, для решения поставленной в работе цели необходимо было провести сравнительную оценку материалов, обладающих нефтепоглощающей способностью и являющихся перспективными для их практического применения в качестве сорбентов-носителей микроорганизмов-нефтедеструкторов.

В качестве объекта исследований рассматривали природные и синтетические материалы, обладающие физической поверхностью сорбции: торф, глауконит, уголь каменный или поглощающие всем объемом - зола, опилки хвойные, целлюлоза, солома, мох рода Сфагнум, полиуретан, исландский мох (Cetraria islandica), мох сфагнум болотный (Sphagnum palustre). Определяли токсичность материалов, их поглотительную способность (нефтеемкость), время образования конгломерата сорбента с нефтью, плавучесть сорбентов. Результаты обобщены в таблице 1.

Материалы и методики исследования

В ходе исследования отбирались различные образцы нефтесорбентов, которые оценивались по таким критериям, как: сорбционная способность, скорость сорбции нефти и нефтепродуктов, коэффициент цикличности, диапазон рабочих температур, экологичность, класс опасности, гарантийный срок хранения, условия хранения, показатели по уровню сложности извлечения сорбента, степень простоты применения, пожароопасность сорбента, соотношение цены и нефтеёмкости [4; 3].

В качестве объекта исследований служили следующие материалы, которые по данным литературы используются в качестве сорбентов: торф, глауконит, уголь каменный, зола, опил, целлюлоза, солома, полиуретан, исландский мох (Cetraria islandica), мох сфагнум болотный (Sphagnum palustre).

Подготовку, разведение и посев культуры УВОМ (Rhodococcus sp.) из коллекции кафедры микробиологии ВятГУ проводили в соответствии с указаниями ГИСК имени Л.А. Тарасевича. Промежуточное хранение культур осуществлялось в холодильной камере при температуре 4–6˚С. Культивирование производилось в термостатах ТБС-80 при 28˚С.

Жидкие и плотные питательные среды готовили из сухих коммерческих препаратов в соответствии с прилагаемыми к ним инструкциями. Использовали следующие питательные среды: ГМФ агар, среда Ворошиловой-Диановой, физиологический раствор хлорида натрия.

Оценку нефтеёмкости сорбентов проводили по специальной методике для определения сорбционной способности материалов [9]. Токсичность проб определяли согласно инструкции к прибору «Биотокс – 10М» и методики определения токсичности химических веществ, полимеров, материалов и изделий с помощью бактериального теста «Эколюм». (Методические рекомендации № 01.018-07) [6]. Плавучесть сорбентов и время образования конгломерата изучали согласно методике, изложенной в ТУ 0392-004-04694229-2012 [9].

Оценку биодеструктивной активности микроорганизмов, иммобилизированных на различных сорбентах проводили в соответствии с методическими указаниями для прибора АН-2 [1; 5]. Определение выживаемости иммобилизированных на поверхности сорбента микроорганизмов-нефтедеструкторов и сроков хранения биосорбента осуществляли в соответствии с методическими рекомендациями определения стабильности отраслевых стандартных образцов (ОСО) и других МИБП ускоренным методом [8].

Определение биодеструктивной активности микроорганизмов, иммобилизированных на различных сорбентах была проведена с помощью прибора АН-2 (анализатор нефтепродуктов) согласно методике к прибору АН-2 АИП 2 840.056.1 [1; 5].

Анализируемые пробы содержали 25 см³ среды Ворошиловой-Диановой, один грамм сорбента с нанесенной на его поверхность миллиардной культурой микроорганизма-нефтедеструктора рода Rhodococcus объемом 0,5 мл и 25 мг нефти. Пробы культивировались на шейкере при температуре 28ºС в течение 6 суток. Далее пробы анализировали с помощью прибора АН-2 и сравнивались с контрольными пробами.

Микроскопия образцов нефтесорбентов осуществлялась при помощи стереомикроскопов МБС-10, микроскопия фиксированных препаратов микроорганизмов проводилась на микроскопе Axio Scope A1 Zeiss с фотонасадкой, использовали окрашивание по Граму. Определяли морфологию клеток и принадлежность к систематическим группам [7].

Результаты экспериментальных исследований представлены в виде средних арифметических значений с определением доверительного интервала при уровне вероятности, равном 95 %.

Статистическую обработку осуществляли методами вариационной статистики с использованием параметрического критерия Стьюдента, а также методом корреляционного анализа. Обработку данных осуществляли с помощью пакета программ MS Excel 2002.

Таблица 1.

Характеристика сорбентов, используемых для очистки почвы от нефтезагрязнений

Результаты исследований показали, что все материалы по степени токсичности в отношении люминесцентных бактерий характеризовались как не токсичные. Наибольшая сорбционная способностью была отмечена у материалов, поглощающих нефть всем объемом. Однако, время образования конгломерата (способность сорбента впитывать нефть и тем самым уменьшать объем загрязненной поверхности) у данных материалов имела большую продолжительность по сравнению с другими сорбентами. Торф, уголь и глауконит обладали наибольшей скоростью образования конгломерата с нефтью на загрязненной поверхности воды.

Изучение показателя плавучести сорбентов свидетельствует о том, что помимо мха сфагнума, золы и угля все остальные сорбенты на поверхности воды находились более 30 суток.

Приведенные выше результаты исследований показывают, что целлюлоза, представляющая собой органический волокнистый материал с анизотропной пористостью, наиболее полно удовлетворяет предъявляемым к сорбентам требованиям и может рассматриваться в качестве перспективного носителя для микроорганизмов – нефтедеструкторов.

Клеточная иммобилизация представляет собой процесс прикрепления клеток к поверхности материала, направленный на получение гидродинамических характеристик полученного конгломерата отличных от окружающей среды.

Иммобилизацию культуры в носитель проводили на примере углеводородокисляющих микроорганизмов рода Rhodococcus. Предварительно микроорганизмы подращивали на среде МПА при 28⁰С в течение суток. Затем в колбу содержащую 100 мл культуры нефтедеструктора с КОЕ 5–7 млрд. кл. на мл помещали сорбент в количестве 1 г. Процесс иммобилизации проводили в динамических условиях на роторной качалке при 120 об/мин и температуре 28⁰С в течение 20 мин [11].

Для установления численности жизнеспособных клеток микроорганизмов, адсорбированных на носителе, была проведена десорбция микроорганизмов – нефтедеструкторов из образцов сорбента. Процесс десорбции осуществлялся на роторной качалке (120 об/мин) при 28⁰С в колбе со 100 мл среды Ворошиловой-Диановой, в которую помещались образцы сорбента после иммобилизации микроорганизмов – нефтедеструкторов.

Через 24 часа интенсивного перемешивания и вымывания клеток микроорганизмов из образцов сорбентов определяли клеточный титр жидкой фазы (среды Ворошиловой - Диановой) методом Коха на чашках Петри со средой МПА. Результаты эксперимента представлены в таблице 2.

Рисунок 1. Оценка эффективности иммобилизации клеток нефтедеструктора на сорбенте

Таблица 2.

Результаты определения эффективности иммобилизации клеток микроорганизмов на сорбенте

Результаты показали, что наибольшая эффективность абсорбционной иммобилизации клеток отмечена при использовании в качестве носителя опила – гетеропористого органического сорбента, поглощающего клетки всем объемом. Носитель абсорбировал до 50 % находящихся в иммобилизационной среде клеток нефтедеструктора. На сорбентах с изотропной пористостью, процесс иммобилизации проходил только на поверхности носителя, и, следовательно, количество абсорбированных клеток в системе было в несколько раз меньше.

Сравнительное изучение деструкция нефти в водной среде с использованием как иммобилизованных, так и свободных (внесённых в виде суспензии) клеток показало, что применение сорбента интенсифицировало процесс деградации нефти. Причем иммобилизационная система клетки – носитель на 10–20 % эффективнее интенсифицировало процесс биодеградации нефти. Нефтеокисляющие микроорганизмы.

В результате измерений выявлено, что наибольшая степень утилизация происходила с использованием в качестве сорбента соломы – 99 % и наименьшая с исландским мхом – 88 % (таблица 2). Утилизация нефти во всех образцах прошла более 80 %. Степень утилизации нефтепродукта в % в зависимости от используемого сорбента представлена на рисунке 2.

Рисунок 2. Степень утилизации нефтепродукта в зависимости от используемого сорбента (%)

В результате измерений выявлено, что у свыше 70 % используемых сорбентов с иммобилизованными микроорганизмами-нефтедеструкторами рода Rhodococcus степень утилизации была свыше 90 %.

Определение выживаемости иммобилизированных на поверхности сорбента микроорганизмов-нефтедеструкторов и сроков хранения биосорбента с использованием ускоренного теста.

За основу данного исследования были взяты методические рекомендации «Определение стабильности Отраслевых Стандартных Образцов (ОСО) и других МИБП ускоренным методом» [8].

В начале исследования измеряли активность биосорбента (под активностью понимается число живых бактерий) при предполагаемой температуре хранения (10⁰С). Затем помещали необходимое количество чашек с биосорбентом в термостаты с надлежащей температурой, соответствующей 37⁰С, 50⁰С и 65⁰С. Через определённые промежутки времени образцы биосорбента вынимали из термостата и определяли их активность.

Заключение

1. На основании анализа данных литературы и результатов сравнительного экспериментального исследования различных сорбентов по показателям нефтеёмкости, времени образования конгломерата, плавучести и токсичности проведено их ранжирование. Показана связь этих показателей со структурой сорбентов.
2. Изучена иммобилизирующая способность сорбентов с использованием углеводороокисляющих микроорганизмов рода Rhodococcus. Показано, что наилучшими иммобилизующими свойствами обладает мох рода сфагнум – до 80–90 %, наихудшими – сорбенты с изотропной пористостью – уголь, глауконит, зола.
3. Определена биодеструктивная активность микроорганизмов, иммобилизированных на различных сорбентах. Установлено, что свыше 70 % используемых сорбентов с иммобилизованными микроорганизмами-нефтедеструкторами рода Rhodococcus степень утилизации была свыше 90 %.
4. Оценена выживаемость иммобилизованных на сорбентах микроорганизмов-нефтедеструкторов, представителей рода Rhodococcus. По результатам испытания с помощью ускоренного теста при различных температурных режимах показано, что максимальный срок хранения микроорганизмов, нанесенных на сорбент составляет не более одного года при температуре хранения 10–15°.

Список литературы:

1. Анализатор содержания нефтепродуктов в воде лабораторный АН-2: Руководство по эксплуатации. СПб.: ООО «Нефтехимавтоматика», 2011. – 43 с.
2. Веприкова Е.В. Особенности очистки воды от нефтепродуктов с использованием нефтяных сорбентов, фильтрующих материалов и активных углей // Journal of Siberian Federal university. Chemistry. – 2010. – № 3. – [Электронный ресурс] – Режим доступа. – URL: http://elib.sfu-kras.ru/bitstream/2311/2187/1/10_Veprikova.pdf (Дата обращения 26.11.2015).
3. Волченко Н.Н., Карасёва Э.В. Скрининг углеводородокисляющих бактерий — продуцентов поверхностно-активных веществ биологической природы и их применение в опыте по ремедиации нефтезагрязненной почвы и нефтешлама // Биотехнология. – 2006. – № 2.
4. Губкина Т.Г., Беляевский Т.Г., Маслобоев В.А. Способы получения гидрофобных сорбентов нефти модификацией поверхности вермикулита органосилаксанами // Вестник МГТУ. – 2011. – № 4. – [Электронный ресурс] – Режим доступа. – URL: http://vestnik.mstu.edu.ru/v14_4_n46/articles/767_773_gubki.pdf (Дата обращения 06.09.2015).
5. Количественный химический анализ вод. Методика измерений массовой концентрации нефтепродуктов в воде на анализаторе АН-2 АИП 2 840.056.1: Методические рекомендации. СПб.: ООО «Нефтехимавтоматика», 2011 – 15 с.
6. Методика определения токсичности химических веществ, полимеров, материалов и изделий с помощью биотеста «Эколюм»: Методические рекомендации. – М.: «Федеральное государственное учреждение здравоохранения «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека», 2007. – 16 с.
7. Определение категорий помещений, зданий и наружных установок по взрывопожарной и пожарной опасности. СП. 12.13130-2009. – М.: МЧС России, 2009. – 35 с.
8. Определение стабильности Отраслевых Стандартных Образцов (ОСО) и других МИБП ускоренным методом: Методические рекомендации. – М.: Министерство Здравоохранения Российской Федерации Национальный Орган Контроля Иммунобиологических Препаратов, 2003. – 8 с.
9. Оценка свойств гидрофобизированного торфа сухого при приёмке. ТУ 0392-004-04694229-2012.
10. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии: учеб. пособие. – М.: Дрофа, 2004. – 256 с.
11. Чикина Н.С. Снижение экологической нагрузки от разливов нефти и нефтепродуктов с использованием сорбента на основе пенополиуретана и отходов зерновых культур // Вестник Казанского Технологического Университета. – 2009. – № 6. – С. 184–192.
12. Gertler C., Gerdts G., Timmis K., Golyshin P. Microbial consortia in mesocosm bioremediation trial using oil sorbents, slow-release fertilizer and bioaugmentation // FEMS Microbiology Ecology. – 2009. – Vol. 69. – № 2. – [Электронный ресурс] – Режим доступа. – URL: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1574-6941.2009.00693.x/full (Дата обращения 30.11.2015).