ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПТИМАЛЬНОГО МЕТОДА ГИПЕРИММУНИЗАЦИИ КРОЛИКОВ МИКОБАКТЕРИAЛЬНЫМ АНТИГЕНОМ

DETERMINATION OF THE OPTIMAL METHOD HYPER IMMUNIZING RABBITS WITH MYCOBACTERIAL ANTIGENS

Assiya Borsynbayeva

Master of Veterinary Medicine, PhD doctoral student

Kazakh national agrarian university

Kazakhstan, Almaty

Kairat Turgenbayev

 Doctor of veterinary science, professor

Kazakh Scientific Research Veterinary Institute (KazNIVI)

Kazakhstan, Almaty

Nikolay Ivanov

Doctor of veterinary science, professor, Academy NAS RK

Kazakh national agrarian university

Kazakhstan, Almaty

Ladislav Molnar

PhD doctor, professor Institute of Veterinary Medicine and Pharmacy

Slovakia, Kosice

АННОТАЦИЯ

В данной статье предложены методики гипериммунизации кроликов. С целью получить гиперимунную сыворотку для экспресс диагностики туберкулеза животных. Предложен способ гипериммунизации кроликов по методу Б.Н. Козьмина-Соколова с неполным адъювантом Фрейнда для быстроты проведения полного цикла иммунизации.

ABSTRACT

In this article the methods hyperimmunization rabbits. In order to receive giperimunnuyu serum for rapid diagnosis of animal tuberculosis. A method hyperimmunization rabbits BN method Kozmina-Sokolov with incomplete Freund's adjuvant for the speed of the total immunization cycle.

Ключевые слова: гипериммунизация; антиген; антитела; сыворотка; адъювант.

Keywords: hyperimmunisation; antigen; antibodies; serum; adjuvant.

Гипериммунизация, метод усиленной, многократной и продолжительной иммунизации, применяемый исключительно у животных в целях получения от них высокоактивных лечебно-предохранительных или диагностических сывороток. Метод Гипериммунизации покоится на общетеоретических основаниях иммунобиологии, подтвержденных опытами, что при искусственном введении в животный организм в том или ином виде антигенов - бактериальных культур, токсинов, экстрактов и вообще белковых веществ в нем образуются через определенные сроки защитительные тела антитела, которые концентрируются главным образом в сыворотке крови гипериммунизированного животного. Для приготовления диагностических сывороток (гемолитических, аглютинирующих и преципитирующих) наиболее подходят из мелких лабораторных животных-кролики; от морских свинок, крыс и мышей сыворотки получаются как правило лишь с небольшим титром [3 с. 231].

Основной целью гипериммунизации является создание таких условий, при которых становится возможным получение от продуцентов высокоактивной специфической сыворотки.

Одним из важнейших моментов, обеспечивающих успех сывороточного производства, является подбор продуцентов, так как животные, и, в частности, лошади, с иммунологической точки зрения оказываются далеко не равноценными.

Успех иммунизации зависит, с одной стороны, от физиологических особенностей организма продуцента, их возраста, пола, породы, физического состояния, ухода и кормления, с другой, — от условий иммунизации и эксплуатации, при этом важное значение имеют качество и доза применяемого антигена, схема иммунизации, место введения, время кровопускания и ряд других моментов [4, с. 362].

Большая роль в успехе эксплуатации животных-продуцентов принадлежит индивидуальной иммунологической реактивности.

В связи с этим подобрать методы гипериммунизации кроликов для получения высоко активной сыворотки для использования их в диагностике является – один из актуальных вопросов.

Целью наших исследований является получение гипериммунной сыворотки для экспресс диагностики туберкулеза животных.

Материалы и методы исследования

Материалом для исследования служили музейные штаммы – Mycobacterium bovis №8, синтетическая питательная среда Сотона, всего на протяжении опыта было использовано 18 кроликов.

Получения специфических антигенов для гиперимунизации кроликов Микобактерии бычьего вида, штамм M.bovis № 8 использовали для приготовления специфических антигенов [1, с. 19].

Культуру микобактерий, выращенную на поверхности жидкой питательной среды Сотона в течение 45 суток, обезараживали стерилизацией в течение 90 мин при 1 атм. Затем бактериальную массу отделяли от жидкой питательной среды фильтрованием. Из полученной биомассы (ретентант) готовили взвесь микобактерий в 50 см³ дистиллированной воды, до концентрации 50 мг/см³, помещали в специальный сосуд с принудительным водяным охлаждением и разрушали в поле ультразвуковых волн при чистоте колебаний 22 кГц и экспозиции 10 мин на аппарате УЗДН-А. Полученную суспензию центрифугировали в течение 30 мин при 8000 об/мин, Осадок ресуспензировали физиологическим раствором и доводили концентрацию белка до 10 мг/ см³.

Кроликов поделили на 3 опытные группы по 6 в каждой.

При изыскании оптимального метода гипериммунизации кроликов микобактериями туберкулеза, с целью получения высоко активной позитивной сыворотки нами было испытано следующие три методических приема:

Метод М. Павласа, описанный М.В. Макаровой [2, с. 23], сущность которого заключалась в иммунизации кроликов бактериальной взвесью, приготовленной по вышеописанной схеме, подкожно в шесть точек спины последовательно вдоль позвоночного столба.

Объем вводимой взвеси составлял 3 см³ суммарно для каждого кролика, то есть 0,5 см³ в каждую точку введения. Иммунизация проводилась в два цикла. Каждый цикл иммунизации состоял из трех введений с интервалом 2 недели. Интервал между двумя циклами составил 1 месяц.

Отбор крови для получения гипериммунных сывороток производился через 3 недели после завершения иммунизации.

Иммунизации кроликов бактериальной взвесью проводили подкожно в шесть точек спины, последовательно вдоль позвоночного столба. Через 2 недели брали кровь, отделяли сыворотку и использовали для постановке РП;

2. Метод иммунизации по Б.Н. Козьмину-Соколову [5, с. 112]. Суть данного метода заключается в проведении двух циклов иммунизации, каждый из которых включал 4 внутривенных инъекции в краевую ушную вену.

Первая инъекция включала введение 0,5 см³ взвеси, полученной из бактериальной массы, подвергнутой ультразвуковой дезинтеграции в течение 10 мин в частоте 22 кГц мощностью до 70 Вт/см² с последующей инактивацией при 90 ⁰С в течение 30 мин.

Вторая инъекция бактериальной взвеси проводилась через 3 дня после первой, объем ее составлял 1,0 см³.

Кровь у животного отбирали по истечению 3 недель после последней инъекции. Затем отделяли сыворотку и исследовали в РП.

3. Метод Б.Н. Козьмина-Соколова включал добавление в бактериальную взвесь неполного адъюванта Фрейнда. Иммунизация по предложенному методу проводилась следующим образом: первое введение антигена с неполным адъювантом Фрейнда производилось в пальцевой мякиш задней лапки кролика подкожно в объеме 0,1 см³.

После первого введения на 7 сутки произошло увеличение подколенного лимфоузла соответствующей лапки. В этот увеличенный лимфоузел через одну неделю осуществляли второе введение антигена в том же объеме, что и при первом введении - 0,1 см³.

Сложность этого метода иммунизации состоит в том, что из-за смешивания антигена с адъювантом она приобретает густую, сметанообразную, консистенцию, а при охлаждении застывает. Поэтому препарат перед введением необходимо разогревать в водяной бане при 40 – 45 ^оС. Для того, чтобы при инъекции антиген не забивал иглу нами были использованы шприцы с металлическими многоразовыми иглами большего диаметра.

Через 10 дней после завершения второго цикла иммунизации провели отбор проб крови из краевой вены уха кроликов, которые предварительно обрабатывали ксилолом. От каждого кролика отобрали по 2-3 см³ крови. Для получения сыворотки пробы крови поместили в термостат при 37⁰С на 1 час, обвели полученный сгусток стерильной металлической спицей и слили сыворотку в отдельную пробирку.

Полученные сыворотки крови исследовали в РП. В результате исследований полученных гипериммунных сывороток крови посредством РП показали крайне низкие титры антител в сыворотках крови кроликов, иммунизированных по методам М. Павласа и Б.Н. Козьмина-Соколова, не превышавший (1:4 до 1:8). По методу Б.Н. Козьмина-Соколова с неполным адъювантом Фрейнда, титр антител полученных от иммунизированных кроликов показал достаточно высокий титр антител (от 1:16 до 1:32).

Сравнительная оценка активности гипперимунных сывороток, полученных тремя указанными методами приведена в таблице 1

Таблица 1.

Сравнительная оценка активности гипперимунных сывороток, полученных разными методами

Из приведенных в таблице 1 видно, что наиболее эффективным оказался модифицированы нами пролонгированный метод Б.Н. Козьмина-Соколова с неполным адъювантом Фрейнда гипперимунизации кроликов, с целью получения позитивной сыворотке для последующих исследований.

Рисунок 1. Титры антител в сыворотках крови кроликов, иммунизированных методам Б.Н. Козьмина-Соколова с неполным адъювантом Фрейнда

На представленном рисунке 1 четко видна линия преципитации между центральной лункой и разведениями сыворотки крови от цельной до 1:32.  Приведенные в таблице 1 и рисунке 1 данные свидетельствуют о достаточно высокой эффективности примененного нами метода иммунизации кроликов антигенами с неполным адъювантом Фрейнда. Таким образом, учитывая высокую эффективность метода иммунизации подопытных кроликов с применением бактериальной взвеси, смешанной с неполным адъювантом Фрейнда, его простоту и удобство применения, а также быстроту проведения полного цикла иммунизации, можно рекомендовать его в качестве основного при проведении аналогичных исследований.

Список литературы:

1. Золотов В.С. Дезинтеграция микобактерий ультразвуком как метод приготовления туберкулезных антигенов для серологических реакций: автореф. ... канд. вет. наук: 16.00.03. – Фрунзе. 1969. 19 с.
2. Макарова М.В. Идентификация M. bovis, М. avium, М. kansasii, М. smegmatis с помощью моноспецифических антисывороток: автореф. ... канд. вет. наук: 16.00.03. – М., 1991. 23 с.
3. Медуницин Н.В. Руководство по иммунологии. М.: Медгиз, 1973. 231 с.
4. Петров Р.В. Иммунология. М.: Медицина, 1985. 362 с
5. Guide for laboratory exercises in medical Microbiology, Virusology and Immunology / Borisov, L.B., Kozmin-Sokolov B. N., Freidlin I. S. / M: Medicine, 1984 p.112